Fluoreszenzbildgebung der Kalziumdynamik an neuromuskulären Verbindungen im Zwerchfell einer transgenen Maus

Zusammenfassung

Quelle: Heredia, D. J., et. al. ex vivo Bildgebung des zellspezifischen Calcium-Signalwegs an der dreigliedrigen Synapse des Maus-Zwerchfells. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung der Calciumdynamik an neuromuskulären Junktionen (NMJs) in einer transgenen Maus, die genetisch kodierte Calciumindikatoren exprimiert. Eine NJM wird durch fluoreszenzmarkierte Acetylcholinrezeptoren im Zwerchfell mit dem Nervus phrenicus identifiziert. Ein Bildsplitter wird verwendet, um mehrere Signale gleichzeitig zu visualisieren. Ein elektrischer Stimulus wird abgegeben, und die Änderung der Fluoreszenz am NMJ als Reaktion auf den Kalziumeinstrom wird aufgezeichnet.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung von Tieren überprüft und genehmigt.

1. Präparation der Zwerchfelle und Zwerchfellnerven von transgenen Mäusen

1. Kaufen Sie transgene Mäuse und Oligonukleotid-Primer, um diese Mäuse zu genotypisieren.
   1. Züchten Sie eine 3 bis 6 Monate alte Maus, die eine Kopie des entsprechenden transgenen/knock-in-Cre-Treiber-Allels und null Kopien des bedingten GCaMP3/6-Allels exprimiert, mit einer zweiten Maus gleichen Alters, die ein oder zwei Kopien des bedingten GCaMP3/6-Allels und null Kopien des Cre-Treiber-Allels exprimiert.
   2. Genotypisieren Sie die Jungtiere und markieren Sie diejenigen mit Cre- und bedingten GCaMP3/6-Allelen – diese werden von nun an als doppeltransgene Mäuse bezeichnet (z. B. Myf5-Cre, bedingtes GCaMP3).
      Hinweis: Auf diese Weise stammen alle Daten von Mäusen, die eine Kopie sowohl von Cre- als auch von bedingten GCaMP3/6-Allelen exprimieren. Dies ist besonders wichtig, wenn andere mutierte Mäuse (z. B. Knockouts) zu diesen Kreuzungen hinzugefügt werden.
2. Wenn die doppeltransgenen Mäuse das entsprechende Alter erreicht haben (z. B. postnataler Tag 0 oder 5 [P0 oder P5] oder adult), euthanasieren Sie die Mäuse, indem Sie sie mit einer Schere enthaupten (bei Mäusen, die jünger als P10 sind) oder indem Sie sie in eine Isofluran-Inhalationskammer legen. Wenn sie nicht mehr darauf reagieren, den Schwanz mit einer Pinzette einzuklemmen, sind sie bereit für das Opfer.
3. Opfere das Tier durch Enthauptung mit einer Schere.
4. Querschnitt über das gesamte Tier direkt unterhalb der Leber und knapp über Herz und Lunge mit einer Iridektomieschere.
5. Präparieren Sie die Leber, das Herz und die Lunge und achten Sie darauf, dass der Nervus phrenicus lang genug ist, um in eine Saugelektrode gezogen zu werden (z. B. 1 - 2 cm).
   Hinweis: Der linke Zwerchfellnerv kann als weißes Gewebestück identifiziert werden, das in den medialen Teil des linken Zwerchfells eintritt. Es darf bei der Entnahme der Lunge nicht geschnitten werden. Der rechte Nervus phrenicus verläuft in einem Stück Faszie, das auch die obere Hohlvene enthält und dünner und weißer als die Hohlvene ist. Zusammen durchdringen beide das rechte mediale Zwerchfell.
6. Entfernen Sie außerdem den Brustkorb und die Wirbelsäule, bis auf den dünnen Grat um das Zwerchfell.
7. Das Zwerchfell und die Probe des Nervus phrenicus in ein Mikrofugeröhrchen mit Krebs-Ringer-Lösung mit 1 μg/mL 594-αBTX für 10 min im Dunkeln geben.
   Hinweis: Diese Konzentration von 594-αBTX markiert Acetylcholinrezeptoren (AChRs), ohne deren Funktion zu blockieren (persönliche Beobachtung).

2. Stimulation und Aufzeichnung der Muskelaktionspotentiale

1. Mit winzigen Stiften das Zwerchfell immobilisieren, indem es auf eine 6 cm dicke Schale gesteckt wird, die mit dielektrischem Silikongel beschichtet und mit ~8 mL sauerstoffhaltiger Krebs-Ringer-Lösung gefüllt ist, und legen Sie es auf den Mikroskoptisch. Perfundieren Sie das Diaphragma 30 min lang mit mehr Krebs-Ringer-Lösung (8 mL/min).
   Hinweis: Dadurch wird das ungebundene 594-αBTX gespült und das Gewebe nach der Dissektion ausgeglichen.
2. Stellen Sie eine Saugelektrode nach den etablierten Methoden her.
   1. Bewegen Sie die Saugelektrode bei 4-facher Vergrößerung mit einem Mikromanipulator über den linken Nervus phrenicus und üben Sie einen Sog aus, indem Sie den Zylinder einer 5-ml-Spritze herausziehen, die mit dem an der Saugelektrode befestigten Schlauch verbunden ist.
      Hinweis: Nach erfolgreichem Einziehen in die Saugelektrode wird der Nervus phrenicus angespannt. Schalten Sie den Stimulator ein und stimulieren Sie den Zwerchfellnerv, indem Sie den Handschalter um 1x umlegen.
   2. Stellen Sie sicher, dass sich das Zwerchfell als Reaktion auf die 1-Hz-Stimulation zusammenzieht, indem Sie es visuell mit Hellfeldbeleuchtung untersuchen. Wenn nicht, stellen Sie die Spannung ein, indem Sie den Spannungsknopf schrittweise drehen, um einen supramaximalen Impuls zu erreichen, der durch eine visuelle Untersuchung der Muskelkontraktion überprüft werden kann. Wenn immer noch nicht sichtbar, blasen Sie den Nerv mit der Spritze aus und versuchen Sie, ihn durch Saugen wieder einzuziehen.
3. Schalten Sie die Perfusion aus und fügen Sie den muskelspezifischen Myosininhibitor BHC6 oder den spannungsgesteuerten Natriumkanalantagonisten μ-Conotoxin8 bis zu einer Endkonzentration von 100 μM hinzu.
   1. Um 100 μM BHC herzustellen, pipettieren Sie 4 μl 200 mM Stamm in DMSO und verdünnen Sie es in 1 mL Krebs-Ringer-Lösung.
   2. 1 ml Krebs-Ringer-Lösung aus der Schale nehmen.
   3. Den vorverdünnten BHC in die Schüssel geben.
      Hinweis: Diese Vorverdünnung hilft, die Induktion einer nicht-transienten Fluoreszenzreaktion durch unverdünntes DMSO in GCaMP3-exprimierenden Zellen zu verhindern.
   4. Warten Sie 30 Minuten und schalten Sie dann die Perfusion der frischen Krebs-Ringer-Lösung für weitere 20 - 30 Minuten ein.
4. Bereiten Sie die Aufnahmeelektrode vor.
   1. Legen Sie mit Handschuhen ein Borosilikat-Filamentglas mit einem Außendurchmesser (OD) von 1 mm und einem Innendurchmesser (ID) von 0,4 mm in einen Mikropipettenabzieher, ziehen Sie die Einstellräder fest, um es in Position zu klemmen, und schließen Sie die Abziehtür.
   2. Programmieren Sie mit einem P-97-Abzieher die folgenden Einstellungen: Hitze bei 900, Zug bei 120, Geschwindigkeit bei 75, Zeit bei 250, Druck bei 500 und keine zusätzlichen Schleifen.
      Hinweis: Der Widerstand (R) wird mit der Softwaresteuerung des Verstärkers gemessen: Die Datenerfassungssoftware bestätigt den Widerstand, indem sie die Formel V = IR löst. Der Software-Controller leitet einen bekannten Strom (I) (typischerweise 1 nA) durch die Elektrode und misst die Änderung der Spannung (V), wodurch wir in die Lage versetzt werden, nach R zu lösen.
   3. Bei embryonalen Membranen ist darauf zu achten, dass der Widerstand nahe 60 MΩ liegt, und bei älteren Membranen 10 - 20 MΩ. Laden Sie die Aufzeichnungselektrode mit 3 M Posatiumchlorid (KCl).
5. Senken Sie die Elektrode bei 10-facher Vergrößerung in den Muskel ab und verwenden Sie einen zweiten Mikromanipulator auf der gegenüberliegenden Seite des Tisches als Stimulationselektrode.
6. Warten Sie mit Hilfe einer elektrophysiologischen Datenerfassungssoftware, bis sich das Ruhemembranpotential von 0 bis -65 mV oder darunter ändert.
7. Stimulieren Sie bei 1 Hz und überprüfen Sie das Vorhandensein eines Muskelaktionspotentials, indem Sie auf ein großes Potential prüfen, das ein geringes Überschwingen aufweist (Potential, das über 0 mV steigt, wenn es bei -65 mV oder darunter beginnt). Verwechseln Sie ein Stimulationsartefakt nicht mit einem Aktionspotential.
   Hinweis: Potentiale haben eine deutlich längere Dauer (~5 ms) als Stimulationsartefakte.

3. Bildgebung der Fluoreszenz der Probe

1. Bei 20-facher Vergrößerung lokalisieren Sie das Endplattenband in der Mitte des Muskels, indem Sie unter Anregung von grünem/gelbem Licht (550 nm) nach 594-αBTX-markierten neuromuskulären Verbindungen oder NMJs suchen. Wechseln Sie zur Blaulichtanregung (470 nm), um Ca²⁺ Reaktionen in Muskel-, Motoneuronen- oder Schwann-Zellen abzubilden.
2. Falls gewünscht, können Sie den Bildsplitter mit Bandpassfiltern und einem dichroitischen Einkantenfilter für die Bildgebung mit zwei Wellenlängen einrichten.
3. Zur Berechnung der maximalen Fluoreszenz (Fmax) von GCaMP3/6-exprimierendem Gewebe werden 12 μl 3 M Kaliumchlorid (KCl) zu den Zwerchfellpräparaten hinzugefügt.
   1. Führen Sie Experimente durch, bei denen der Helligkeitsbalken in der Nachschlagetabelle auf 110 % des Niveaus eingestellt ist, bei dem das GCaMP3/6-exprimierende Gewebe bei 20-facher Vergrößerung eine Sättigung aufweist, ohne dass es als Reaktion auf KCl Binning gibt.
4. Nehmen Sie mit 20 Bildern pro Sekunde auf, um keine schnellen Ereignisse zu verpassen.
5. Stimulieren Sie mit 1 - 45 s von 20 - 40 Hz Nervenstimulation, indem Sie mit der Saugelektrode eine Reihe von Impulsen abgeben, oder fügen Sie pharmakologische Agonisten durch Badanwendung oder Perfusion hinzu und sammeln Sie dynamisch fluoreszierendes Ca²⁺ Reaktionen in einem Zellsubtyp zusammen mit dem statischen 594-αBTX NMJ-Signal.
   Hinweis: Wenn gewebespezifische rote oder dunkelrote genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECI) oder genetisch kodierte Spannungsindikatoren (GEVI) Mäuse für den Einsatz am NMJ verfügbar werden, können sie verwendet werden, um zwei dynamische Signale zu sammeln, die zwei unterschiedliche zelluläre Elemente am NMJ reflektieren.
6. Wenn die bildgebenden oder elektrophysiologischen Experimente beendet sind, weil die gewünschten Ergebnisse erzielt wurden, perfundiertes Wasser durch die Perfusionsleitungen und Wasser 2x - 3x durch die Saugelektrode ansaugen, um sicherzustellen, dass sich keine Salze bilden.

Materialien