Zwei-Photonen-Mikroskopie von Astrozyten und exzitatorischen Neuronen in einem gereinigten Hippocampusgewebe der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Refaeli, R., et al., Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen im gereinigten Gehirn. J. vis. exp. (2022)

Das Video zeigt die Vorbereitung von eine Kammer und die Bildgebung von geklärtem Hippocampusgewebe der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die räumlichen Wechselwirkungen zwischen fluoreszenzmarkierten Astrozyten und exzitatorischen Neuronen sichtbar zu machen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen ethischen Überprüfungskommission für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung der Kammer

HINWEIS: Jede Probe benötigt einen Objektträger mit einer Bildgebungskammer, in der die Probe platziert wird.

1. Platzieren Sie das Beispiel in der Mitte der Folie.
2. Erzeugen Sie mit einer Heißklebepistole Wände an den Rändern des Objektträgers, die fast so hoch wie das Gewebe sind. Achten Sie darauf, dass Sie an einer der Ecken einen kleinen Spalt (ca. 5 mm) lassen (Figure 1A, B).
3. Tragen Sie 1-2 Tropfen der Brechungsindex-Matching-Lösung oder RIMS auf die Probe auf, um die Oberseite feucht zu halten und zu verhindern, dass sich Blasen zwischen dem Deckglas und dem Gewebe bilden.
4. Unmittelbar nach dem Auftragen der RIMS-Tropfen (Refractive Index Matching Solution) die letzte Schicht Heißkleber auf die Wände auftragen (so dass sie die Höhe des Gehirns/der Scheibe erreichen) und sofort (solange der Heißkleber noch flüssig ist) mit Schritt 1.5 fortfahren.
5. Versiegeln Sie die Oberseite mit einem Deckglas und legen Sie es so gleichmäßig wie möglich auf die noch warme Heißklebeschicht (Abbildung 1C).
6. Füllen Sie die Kammer mit den RIMS durch die Lücke in den Heißkleberwänden (Figure 1D, E).
7. Schließen Sie die Lücke mit Heißkleber. Lassen Sie keine Luft im Inneren (Figure 1F).
8. Wenn die Heißkleberwände über die Ränder der Folie hinausragen, schneiden Sie die sich verlängernden Kanten ab (Figure 1G).
9. Wenn das Objektiv, das für die Bildgebung verwendet wird, eingetaucht ist, fügen Sie weitere 2-3 mm Kleber auf die Wände über dem Deckglas hinzu, damit die Immersionslösung länger hält (Abbildung 1H).

Ergebnisse

Materialien