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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Morphologische Analysen von Kleinhirngranulaneuronen oder CGNs - dreidimensionale (3D) Rekonstruktion und Oberflächen- und Zellvolumen
- Einzelne elektroporierte CGNs auf einem konfokalen Mikroskop bei 63-fachem Objektiv mit 2-fachem Zoom abbilden, wobei Z-Stapel-Bilder mit 0,5 μm pro Stapel aufgenommen wurden. Bild eine Zelle pro Bildfenster, um eine einfache Bildanalyse und -rekonstruktion zu ermöglichen.
- Installieren Sie das Simple Neurite Tracer Plug-in für Fidschi über den folgenden Link (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), um die Struktur von elektroporierten CGNs im dreidimensionalen (3D) Raum einfach und effizient zu verfolgen.
HINWEIS: Es gibt eine aktualisierte Version des Plug-ins (https://imagej.net/SNT).
- Analysieren Sie die Neuritenlänge und die Bildung der dendritischen Klauen auf verblindete Weise mit einem einfachen Neuriten-Tracer. Laden Sie einkanalige Z-Stack-Bilder von elektroporierten CGNs auf FIJI hoch und klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Einfacher Neurit-Tracer (Abbildung 1D).
- Rufen Sie das Dropdown-Menü auf, und wählen Sie Neuen 3D-Viewer erstellen (Abbildung 1D) aus.
- Scrollen Sie zur Basis eines Dendriten, wo er mit dem Zellsoma verbunden ist, und beginnen Sie einen Pfad, indem Sie auf die Verbindung klicken. Verfolgen Sie den Pfad manuell, indem Sie sich durch die Abschnitte klicken, in denen das Zellfüllsignal am hellsten ist, und [y] drücken, um die Spur beizubehalten. Verfolgen Sie bis zum Ende des Dendriten, wenn er keine Kralle enthält, oder bis zur Basis der Klaue und bestätigen Sie den Weg mit [f] (Abbildung 2D).
- Verfolgen Sie als Nächstes die Klaue, indem Sie einen Pfad an der Basis der Struktur beginnen und bis zum Ende des längsten Neuriten verfolgen. Verfolgen Sie sekundäre und tertiäre Verzweigungen, indem Sie [Strg] unter Windows oder [Alt] unter Mac OS gedrückt halten und auf den Pfad klicken. Bestätigen Sie den Pfad mit [f].
- Beachten Sie, dass die Messungen für die Kurven in einem separaten Fenster sichtbar sind. Addieren Sie alle Maße der Klauenäste (primär, sekundär, tertiär), um die Gesamtlänge für jede Klaue zu erhalten.
- Um die Oberfläche und das Zellvolumen von elektroporierten CGNs zu analysieren, laden Sie die Imaris Zellanalysesoftware herunter (https://imaris.oxinst.com/).
HINWEIS: FIJI kann auch verwendet werden, um Zellen in 3D aus Z-Stack-Bildern mit leicht verfügbaren und kostenlosen Plug-ins zu rekonstruieren. Darüber hinaus verfügt Simple Neurite Tracer über eine volumetrische Rendering-Funktion, aber Imaris wurde aus den unten genannten Gründen verwendet.
- Laden Sie ein Z-Stack-Bild eines elektroporierten CGN auf Imaris hoch. Greifen Sie auf das 3D-Rekonstruktions-Toolkit zu, indem Sie auf Surpass drücken.
- Um den CGN zu rekonstruieren, drücken Sie die Taste Oberflächen, und wählen Sie einen Interessenbereich aus, der die gesamte Zelle im Bildfenster umfasst. Wenn Sie fertig sind, drücken Sie auf den blauen Vorwärtspfeil in der unteren rechten Ecke unter Erstellen.
- Wenn das Bild mehrere Kanäle für unterschiedliche Signale enthält, wählen Sie den Kanal aus, der das elektroporierte CGN enthält, und drücken Sie den blauen Vorwärtspfeil.
- Legen Sie in der Seitenleiste einen gewünschten Schwellenwert fest, der am genauesten zum Signal der elektroporierten Zelle passt. Vergrößern Sie die Maus näher an die Oberfläche der Zelle, um den Schwellenwert genau zu bestimmen. Wenn Sie fertig sind, drücken Sie auf den doppelten grünen Pfeil, um die Zelle zu rekonstruieren und die Oberfläche und die Volumengröße aus den Metadaten zu erhalten.
