Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Zusammenfassung

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp., (2022)

Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

In vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia und neuronaler Kalziumdynamik

1. Gewöhnung der Mäuse an das Mikroskopgerät

1. Drei Wochen nach der Operation die Maus mit 3% Isofluran anästhesieren und die Maus mit einem speziell angefertigten stereotaktischen Instrument unter die 25-fache Objektivlinse eines Zwei-Photonen-Mikroskops setzen (Abbildung 1C). Für die Einrichtung wird die Maus auf die Oberseite eines Laufbandes gesetzt und darf frei laufen.
2. Nehmen Sie die Maus etwa 10 Minuten später vom Mikroskoptisch und bringen Sie sie wieder in den Heimkäfig zurück. Wiederholen Sie die Gewöhnung mindestens 3 Mal jeden zweiten Tag vor der Zwei-Photonen-Bildaufnahme.

2. Zwei-Photonen-Bildaufnahme

HINWEIS: Wir empfehlen, die Bildaufnahme mehr als 4 Wochen nach der Operation durchzuführen, da die Mikrogliaaktivierung allmählich auf das basale Niveau zurückkehrt.

1. Induzieren Sie bei der Maus eine Anästhesie mit 3% Isofluran und setzen Sie die Maus mit einem speziell angefertigten stereotaktischen Instrument unter die Objektivlinse des Zwei-Photonen-Mikroskops.
2. Installieren Sie die speziell angefertigte Beschattungsvorrichtung (Abbildung 1A und Abbildung 1B) und einen LCD-Monitor für die visuelle Stimulation, wie unten beschrieben (Abbildung 1D).
   1. Positionieren Sie das Objektiv so, dass es auf die Gehirnoberfläche fokussiert wird, und legen Sie dann diese Objektivposition als ursprüngliche Z-Position fest. Halten Sie die x-y-Koordinaten konstant und erhöhen Sie die Objektivlinse; Entfernen Sie die Maus und das stereotaktische Instrument von der Objektivlinse und dem Laufband.
   2. Befestigen Sie eine Beschattungsvorrichtung mit Silikon an der Oberseite der Kopfplatte, das durch Mischen mit Holzkohlepulver geschwärzt wird, und stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen der Kopfplatte und der Beschattungsvorrichtung gut abgedichtet ist.
   3. Füllen Sie das Beschattungsgerät mit destilliertem Wasser und befestigen Sie dann die Maus und den stereotaktischen Rahmen wieder unter dem Objektiv und auf dem Laufband. Setzen Sie die Brennebene vorsichtig an der Gehirnoberfläche zurück und überprüfen Sie die Tiefe der Objektivlinse.
      HINWEIS: Um das Risiko einer Beschädigung der Objektivlinse zu vermeiden, stellen Sie zuerst die xyz-Koordinaten ein und bringen Sie dann die Schattierungsvorrichtung der Objektivlinse an. Es ist auch sinnvoll, zuerst die Abdeckung zu installieren und dann die Koordinaten anzupassen, aber für diese Option ist eine vorsichtige Handhabung erforderlich.
   4. Decken Sie die Objektivlinse mit schwarzer Aluminiumfolie ab, um Lichtverschmutzung durch den LCD-Monitor zu vermeiden, der für die visuelle Stimulation durch die Objektivlinse verwendet wird (Abbildung 1D). Stellen Sie einen 10-Zoll-LCD-Monitor 12,5 cm vor den Augen der Maus auf, um visuelle Reize darzustellen (Abbildung 1D).
3. Konfigurieren Sie die Fluoreszenzemissionssammelfilter auf EGFP-Fluoreszenz (525/50 nm Emissionsfilter) und R-CaMP-Fluoreszenz (593/46 nm Emissionsfilter) und die Anregungswellenlänge auf 1.000 nm. Erfassen Sie Bilder mit einer räumlichen Auflösung von 0,25 μm/Pixel mit einem 25x 1,1 NA-Objektiv und GaAsP-PMTs.
4. Finden Sie den Bildgebungsbereich, in dem R-CaMP (+)-Neuronen und EGFP (+)-Mikroglia gleichzeitig in Schicht 2/3 abgebildet werden können. Für diesen Aufbau wurden die in Abbildung 2 erhaltenen Daten in einer Tiefe von 100 μm von der Pial-Oberfläche unter Verwendung einer Live-Bildvorschau aufgenommen. Halten Sie die Leistung des Anregungslasers so gering wie möglich, um Photobleiche und Schäden durch erhöhte lokale Temperatur im Bildgebungsbereich zu vermeiden.
5. Erfassen Sie Bilder mit einer Bildrate von 30 Hz. Gleichzeitig mit der Bildaufnahme präsentieren Sie der Maus einen drifting-knirschenden visuellen Reiz bei 100% Kontrast, 1,5 Hz, 0,04 Zyklen pro Grad in 12 Richtungen bei 6 Ausrichtungen von 0° bis 150° in 30°-Schritten.
6. Nehmen Sie nach der Bildaufnahme die Maus vom Mikroskoptisch, nehmen Sie die Beschattungsvorrichtung und das stereotaktische Instrument von der Maus ab und bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.

Ergebnisse

<

figure class='image image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75%;'>

Materialien