Quantifizierung neu erzeugter Neuronen im Hirngewebe von Ratten mit der optischen Fraktionatortechnik

Abstract

Quelle: Olesen, M. V., et al. Die optische Fraktionatortechnik zur Schätzung der Zellzahl in einem Rattenmodell der Elektrokrampftherapie. J. vis. exp. (2017).

Das Video demonstriert die Technik zur Quantifizierung neu gebildeter Neuronen im Hirngewebe. Hippocampus-Gewebeschnitte, die Bromodeoxyuridin (BrdU)-markierte Neuronen enthielten, wurden mittels Immunhistochemie gefärbt und anschließend mit der optischen Fraktionatortechnik über die Gewebedicke quantifiziert.

Protocol

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen ethischen Überprüfungskommission für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Tissue processing

HINWEIS: Nach transkardialer Perfusion und Postfixierung in 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 0,2 M Phosphatpuffer über Nacht bei 4 °C, wird das Gehirn auf 30% Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für drei Tage bei 4 °C übertragen. Danach werden die Gehirne auf pulverisiertem Trockeneis eingefroren und bis zum Schneiden bei -80 °C gelagert.

1. Trennen Sie die rechte und linke Hemisphäre entlang der Mittellinie des Gehirns mit einem Skalpell. Wählen Sie dann die eine oder andere Hemisphäre zufällig im ersten Gehirn aus. Wechseln Sie danach systematisch zwischen der rechten und linken Hemisphäre (Figure 1A). Montieren Sie die abgetastete Halbkugel mit einem Einbettmedium senkrecht zur Probenscheibe, wobei die Längsachse senkrecht zur Scheibe steht.
2. Platzieren Sie nummerierte Mehrschalenbehälter zur Vorkühlung in den Kryostaten.
3. Montieren Sie die Probenscheibe in den Kryostaten und schneiden Sie den gesamten Hippocampus (Bregma 1,80 bis - 7,04) in 80 μm dicke Abschnitte in der koronalen Ebene (Abbildung 1B).
   1. Platzieren Sie alle abgetasteten Abschnitte nacheinander in den abgekühlten Mehrschalenbehältern, um die Abschnitte in der Schnittreihenfolge zu halten.
   2. Decken Sie die Abschnitte vollständig mit Kryoprotektor ab und halten Sie die Behälter bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.

2. Immunfärbung

HINWEIS: Um den Überblick über die einzelnen Abschnitte während des Färbevorgangs zu behalten, legen Sie die beprobten Abschnitte in 25-Well-Färbenetze. Verwenden Sie jeden 5. Abschnitt, was eine mittlere endgültige Anzahl von 12 (8-16) Abschnitten pro Hippocampus für die Immunfärbung und die anschließende Zellzählung ergibt.

1. Vor der Unterstichprobe jedes n-ten Abschnitts mit einem zufälligen Start zwischen den Abschnitten eins und n (Abbildung 1C), übertrage die Behälter von -20 °C auf Raumtemperatur (RT).
2. Übertragen Sie die Schnitte zum Beispiel mit einem Pinsel in numerischer Reihenfolge auf die 25-Well-Färbenetze, die in mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllten Petrischalen platziert sind.
   HINWEIS: Von diesem Punkt an bewahren Sie die Abschnitte in den Färbenetzen in passenden Glasschalen auf einem Orbitalschüttler auf (Abschnitte 2.3 bis 2.9).
3. Übertragen Sie die Färbenetze in die passenden Glasschalen und waschen Sie die Abschnitte zweimal 10 Minuten lang in PBS bei Raumtemperatur (RT), bevor Sie sie in 3% Wasserstoffperoxid (H₂O₂) verdünnt in destilliertem Wasser (dH₂O) für 20 Min.
4. Übertragen Sie die Schnitte in drei verschiedene Salzsäurelösungen (HCl) (1 M bei 0 °C für 10 min, 2 M bei RT für 10 min und 2 M bei 37 °C für 20 min), bevor Sie 20 min lang in 0,1 M Natriumtetraborat bei RT neutralisieren.
5. Nach 3 × 10 min Inkubation in 1 % Triton X-100, verdünnt in PBS (Waschpuffer), übertragen Sie die Schnitte für 1 h bei RT in einen Waschpuffer mit 10 % fötalem Rinderserum (Blockierungslösung).
6. Die Schnitte werden 48 Stunden lang bei 4 °C in Maus-Anti-BrdU (5-Brom-2'-Desoxyuridin) inkubiert, verdünnt 1:100 in Blockierungslösung.
7. Waschen Sie die Schnitte 3 × 10 Minuten in Waschpuffer und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang in Meerrettichperoxidase, verdünnt 1:10 in Waschpuffer.
8. Übertragen Sie die Abschnitte für 5 × 10 Minuten an PBS und dann für 7 Minuten in 0,01 % Diaminobenzidin (DAB), verdünnt in PBS, bevor Sie in eine ähnliche DAB-Lösung mit 0,02 % H₂O₂ für 10 Minuten bei RT.
9. Führen Sie eine Reihe von Waschgängen durch (2 × 10 min in PBS und 2 × 10 min in Phosphatpuffer ohne Zusatz von Natriumchlorid) und montieren Sie die Schnitte in numerischer Reihenfolge auf Objektträgern.
10. Trocknen Sie die Schnitte ca. 30 Minuten lang, bevor Sie sie mit Cresylviolett gegenfärben.
11. Legen Sie die Objektträger in ein Objektträgergestell.
12. Rehydrieren Sie die Abschnitte für 10 Minuten in Objektträgerfärbeschalen, die dH₂O, und dann übertragen Sie die Folien in 0,02% Cresylviolett in dH₂O für 15 min.
13. Wiederholen Sie Schritt 2.12, bevor die Schnitte dreimal in Ethanol dehydriert werden (96 % für 5 min und 99 % für 2 × 2 min).
14. Legen Sie die Abschnitte für 2 × 15 Minuten in Xylol und decken Sie die Objektträger mit einem schnell trocknenden Medium zur Montage ab.
15. Lassen Sie die Objektträger abschließend ca. 24 h stehen, bevor sie für die Mikroskopie verwendet werden können.

3. Schätzung der Gesamtzahl der BrdU-markierten Neuronen mit dem optischen Fraktionator

HINWEIS: Führen Sie eine Pilotstudie durch, die einige Tiere umfasst, um die optimalen Stichprobenparameter zu bestimmen, wie z.B. die Anzahl der zu analysierenden Abschnitte und die Anzahl der optischen Dissektoren innerhalb der beprobten Abschnitte. Dieses Pilotprojekt bietet auch einen vorläufigen CV (Standardabweichung/Mittelwert) und die Möglichkeit, die CE anzupassen, um eine zufriedenstellende Genauigkeit der vom Prüfarzt ermittelten Schätzungen zu erhalten (weitere Einzelheiten siehe unten). Ebenso befasst sich eine Z-Verteilungsanalyse mit den folgenden Punkten: Gewebeschrumpfung, Qualität der Färbung im gesamten Schnitt und Verteilung der Zellen in der z-Achse.

1. Überprüfen Sie die Dicke des Gewebes in den Abschnitten, um zu bestätigen, dass sie für die Verwendung des optischen Fraktionators geeignet sind, z.B. dick genug für die Höhe des gewählten Dissektors, einschließlich der Schutzzonen (siehe unten). NOTE: Die Gewebedicke wird an mehreren Stellen innerhalb des interessierenden Bereichs gemessen.
   1. Legen Sie die Objektträger auf den motorisierten Tisch des Mikroskops und schalten Sie die bevorzugte stereologische Software ein.
   2. Markieren Sie den interessierenden Bereich mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (2X oder 4X), bevor Sie zu einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv wechseln (siehe Abbildung 2A).
   3. Unter Verwendung eines bestimmten Punktes eines Zählrahmens (z.B., an oder neben einer Ecke), positionieren Sie den oberen Rand des Schnitts, indem Sie ihn entlang der Fokusebene bewegen, bis ein Schnitt-KE im Fokus angezeigt wird. Registrieren Sie diese Z-Position als 0 (siehe Figure 2B).
   4. Bewegen Sie die Fokusebene durch das Gewebe nach unten, bis sich derselbe spezifische Punkt des Zählrahmens auf der letzten z-Ebene des fokussierten Gewebes befindet, und markieren Sie diese Position. Die lokale Gewebedicke wird von 0 bis zu diesem Endpunkt definiert und kann auf der z-Achse abgelesen werden. Registrieren Sie die Gewebedicke (siehe Figure 2B).
2. Dokumentieren Sie die vollständige Durchdringung des Flecks und die Verteilung der Zellen in der vollen Dicke des Schnitts.
   HINWEIS: Die Verteilung der BrdU-markierten Neuronen dient als Anhaltspunkt für die Bestimmung der erforderlichen Schutzzonen. Obwohl eine gleichmäßige Verteilung der Zellen entscheidend ist, ist es akzeptabel, weniger Zellen am oberen und unteren Rand des Schnitts zu beobachten, was auf die Auswirkungen verlorener Kappen hinweist.
   1. Nehmen Sie eine Stichprobe von BrdU-markierten Neuronen und registrieren Sie ihre Z-Position zusammen mit der lokalen Schnittdicke, die in der ausgewählten Ecke jedes Zählrahmens gemessen wurde.
   2. Plotten Sie die Anzahl der BrdU-positiven Neuronen als Funktion ihrer z-Position.
3. Die Höhe der Leiter- und Schutzzonen sollte auf der Grundlage der mittleren Querschnittsdicke und der Verteilung der Zellen festgelegt werden (siehe 3.1 und 3.2).
   NOTE: Die Höhe des Dissektors sollte kleiner als die Schnittdicke sein, um Artefakte in der Nähe der Oberflächen zu vermeiden. Dieses Risiko wird umgangen, indem Schutzzonen am oberen und unteren Rand des Abschnitts eingebaut werden.
4. Bestimmen Sie die Schrittlänge zwischen den Dissektoren.
   1. Beschreiben Sie den interessierenden Bereich auf allen zu analysierenden Abschnitten und registrieren Sie die Bereiche.
   2. Addieren Sie diese Flächen und dividieren Sie durch die Anzahl der in diesem Gebiet platzierten Dissektoren.
      NOTE: Basierend auf den bisherigen Erfahrungen sind 75 Sonden ein guter Ausgangspunkt. Dadurch werden der Bereich und die entsprechenden Stichprobenpositionen angenähert (A_step).
   3. Nimm die Quadratwurzel aus A_step, die die x-y-Schrittgröße liefert.
5. Bestimmen Sie die Größe des Zählrahmens.
   1. Setze die Größe des Zählrahmens auf eine beliebige Einheit und führe eine Pilotstichprobe von BrdU-positiven Neuronen mit den in den Abschnitten 3.3 und 3.4 erhaltenen Parametern durch.
      NOTE: Die Größe muss empirisch durch Versuch und Irrtum bestimmt werden, aber es wird empfohlen, die Probenahme von 2-3 Zellen pro Dissektor zu ermöglichen.
6. Nach diesem letzten Schritt der Pilotstudie beginnen Sie mit der Zellprobenahme.
   HINWEIS: Die erhaltenen Probenahmeparameter sollten zu einer Zählung von etwa 150-200 Zellen in jedem Tier führen, was ausreicht, um ein effizientes stereologisches Design zu erhalten.
7. Zählen Sie die BrdU-positiven Neuronen mit einem 100×Öl-Immersionsobjektiv und einer abschließenden Vergrößerung von 2000-3000×. Identifizieren Sie bei jedem optischen Dissektor alle BrdU-markierten Neuronen, die anhand des interessierenden Merkmals erkannt werden (in der vorliegenden Studie ist das Kriterium, wann die Vorderkante des BrdU-markierten Neurons zum ersten Mal in den Fokus kommt), sich innerhalb des Zählrahmens befinden oder die Einschlusslinien berühren (Abbildung 2B). Zählen Sie nicht die BrdU-positiven Neuronen, die die Ausschlusslinien berühren, wenn sie deutlich durch das interessierende Merkmal innerhalb der Dissektorhöhe erkannt werden. Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Zählregeln während der gesamten stereologischen Quantifizierung sorgfältig zu befolgen.
   NOTE: Da BrdU in alle sich teilenden Zellen eingebaut wird, unterscheidet die Morphologie zwischen Neuronen und anderen Zelltypen. Die Merkmale der Neuronen sind ein klar definierter Zellkern mit einem neutralen Zytoplasma und einem dunklen Nukleolus. BrdU-positive Zellen werden aufgrund ihrer Größe als Gliazellen als neu gebildete Neuronen erkannt. In Studien zur kurzfristigen Proliferation (z.B. < 2,4 h) kann eine Doppelfärbung mit unreifen neuronalen Markern eine Voraussetzung sein.

Results

Materials