Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenauges mittels Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Hellerman, M. B.B.. , et al. Live-Imaging des Drosophila J. Vis. Exp. (2015)

{TAG_ 28}}Das Video zeigt eine Live-Imaging-Technik zur Untersuchung der Augenmusterung bei einer Drosophila melanogaster-Puppe. Grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierte Marker ermöglichen die Visualisierung der zellulären Organisation und Differenzierung während der Bildung der sich entwickelnden Augenstruktur.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:12pt;margin-top:12pt;' dir='ltr'>1. Fluoreszenzbildgebung

1. Stellen Sie sich das Drosophila Puppenpräparation mit einem Fluoreszenzmikroskop. Alle 7 min werden serielle Schnitte durch die apikale Domäne des Augenneuroepithels im Bereich der Adhärensübergänge erfasst.
   HINWEIS: a) Geeignete serielle Abschnitte sind in der Regel 4-5 pro Z-Stapel, bestehend aus 0,2 μm Z-Schritten. b) Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich leichter Beulen und Falten, können es schwierig machen, scharfe Bilder von großen Geweberegionen zu erhalten. Während der Bildgebung kann es vorkommen, dass ein Teil eines interessierenden Bereichs scharf und eine benachbarte Region unscharf ist. Die Aufnahme eines kleinen Tröpfchens destillierten Wassers zwischen dem Puppenauge und dem Deckglas kann einige akute Gewebefalten beseitigen, aber nicht die leicht ungleichmäßige Topologie, die für die frühen Stadien der Puppenauge-Morphogenese charakteristisch ist. In diesen Fällen führen Sie eine Überabtastung des Gewebes durch, indem Sie den Z-Stapel erweitern, bis fokussierte Schichten für das gesamte Feld erfasst werden. c) Die Aufnahme von seriellen Schnitten alle 7 Minuten sollte eine Live-Bildgebung für 3 bis 4 Stunden ermöglichen, ohne dass die Intensität der Fluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) signifikant reduziert wird, was die Bildqualität beeinträchtigen könnte. Kürzere Zeitintervalle können die Gesamtzeit der Bildgebung verkürzen.
2. Setzen Sie die Bildgebung 3 bis 4 Stunden lang fort. Verwenden Sie keine automatische Fokus- und Zeitfunktion, die bei vielen Fluoreszenzmikroskopen verfügbar ist, da das Puppenwachstum und das Pumpen der Hämolymphe die Position der Netzhaut verschieben und alle 14-21 Minuten eine sorgfältige Neufokussierung erforderlich ist.

NOTE: Die Bildgebung nach 4 Stunden kann die Morphogenese des Auges verlangsamen oder verzögern.

3. Verwenden Sie eine geeignete Entfaltungssoftware, um den Hintergrund zu verkleinern und den Kontrast der Serienschnittbilder zu verbessern. Führen Sie für jede Z-Stapel-Datei in der Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF) die folgenden Schritte aus: Navigieren Sie zum Werkzeugbedienfeld, wählen Sie 3D-Dekonvolution und klicken Sie auf Anwenden.
4. Generieren eines maximalen Projektionsbilds (MP) für jede entfaltete Stapeldatei: Navigieren Sie zum Werkzeugbedienfeld, wählen Sie 3D-Projektion aus und klicken Sie auf Anwenden.
   HINWEIS: Der MP-Algorithmus kann möglicherweise kein gleichmäßig fokussiertes Bild für Gewebe erzeugen, das überbewertet wurde.

2. Bildverarbeitung

1. Automatische Bildausrichtung:

HINWEIS: Die Live-Drosophila Gewebe wird sich während des Bildgebungsprozesses verschieben und wachsen. Folglich entsprechen die Zentren von Bildern, die zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten gesammelt wurden, möglicherweise nicht demselben Punkt in der Drosophila Gewebe. Darüber hinaus dreht sich die gesamte Netzhautscheibe zwischen ~21 und 23 Stunden nach der Pupariumbildung (APF) um etwa 30°. Um das Verhalten einzelner Zellen hervorzuheben und Ablenkungen durch das Wachstum von Organismen zu reduzieren, richten Sie jedes MP-Bild aus. Dies kann zwar manuell durchgeführt werden, aber die hier verwendete Bildbearbeitungssoftware verfügt über integrierte Algorithmen, die den Prozess beschleunigen können.

2. Öffnen Sie auf der Registerkarte Datei des Hauptmenüs Skripte und wählen Sie Dateien in Stack laden.
3. Importieren Sie die MP-Bilddateien in das Bedienfeld "Ebenen laden" und wählen Sie "OK". Stellen Sie sicher, dass die Option "Versuch, Quellbilder auszurichten" nicht automatisch ausgewählt ist.
4. HINWEIS: Wenn diese Option ausgewählt ist, verwendet die Software möglicherweise einen Ausrichtungsalgorithmus, der die Bilddaten verzerrt.
5. Nachdem alle MP-Dateien in den Ebenenbereich geladen wurden, stellen Sie sicher, dass alle Bilder in chronologischer Reihenfolge angezeigt werden, sodass sich der früheste Zeitpunkt oben im Ebenenstapel befindet. Wenn die Layer nicht in der richtigen Reihenfolge sind, ziehen Sie sie per Drag & Drop, bis sie richtig sortiert sind.
6. Wählen Sie im Hauptmenü auf der Registerkarte "Bearbeiten" die Option "Ebenen automatisch ausrichten". Wählen Sie Neu positionieren und klicken Sie auf OK.
7. Wenn der Algorithmus für die automatische Ausrichtung die Frames nicht an einem relevanten Fokuspunkt ausrichten kann, nehmen Sie mit dem Verschieben-Werkzeug kleinere Anpassungen vor.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b
UAS-dcr-2; UAS-a-Kat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
25 x 75 x 1 mm Glasobjektträger	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm Glasdeckglas	VWR	48393-172
Pinzette	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3 mm Chromatographiepapier	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291
30 ml Spritze	Fisher Scientific	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
Leica TCS SP5 DM Mikroskop	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 Mikroskopsoftware	Leica Microsystems