Längsschnittliche Zwei-Photonen-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Neuronen in einem lebenden Maus-Hippocampus

Zusammenfassung

Quelle: Ulivi, A. F., et. al. Longitudinale Zwei-Photonen-Bildgebung von dorsalem Hippocampus CA1 in lebenden Mäusen. J. Vis. exp. (2019)

Dieses Video zeigt die longitudinale Zwei-Photonen-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten pyramidalen Neuronen in einer lebenden Maus und zeigt die Vorbereitung, Kanülenausrichtung und Bildgebung von Dendriten und dendritischen Dornen zur Untersuchung der neuronalen Struktur in der hippokampalen CA1-Region.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Bildgebungssitzung
2. Schalten Sie das Bildgebungs-Setup im Voraus ein und lassen Sie den Laser bei Bedarf aufwärmen und stabilisieren.
3. Betäuben Sie die Maus. Platzieren Sie die Maus in der Anästhesie-Induktionskammer bei 3% Isofluran in 1 L/min O₂ und warten, bis es das Bewusstsein verliert. Beurteilen Sie die Anästhesie mit dem Zehenquetschreflextest.
4. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Klebefolie von der Kopfhalterplatte. Halten Sie die Maus in einer Hand und die Kopfhalterplatte mit den Fingern. Entfernen Sie die Folie vorsichtig, um eine Beschädigung der Zubereitung zu vermeiden.
5. Positionieren Sie die Maus unter dem Mikroskop, über dem Heizteppich und befestigen Sie die Kopfplatte an der Halterung (Abbildung 1D).
6. Positionieren Sie den Nasenkegel so, dass er die Schnauze bedeckt, und verringern Sie den Isofluran auf 1,5-2%.
7. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Maus auf.
8. Reinigen Sie die Bildgebungskanüle, indem Sie sie mit entionisiertem Wasser spülen. Verwenden Sie eine Spritze und eine dünne Nadel, um Wasser in die Kanüle zu tropfen, und eine Vakuumpumpe, um es zu entfernen.

2. Imaging session

1. Verwenden Sie Objektive mit geringer Vergrößerung und großem Arbeitsabstand, um die Kanüle visuell auf Restwasser, Schmutz, Unversehrtheit und das Vorhandensein von Fluoreszenz zu überprüfen.
2. Richten Sie die Kanüle auf die optische Achse aus, indem Sie die Winkel der Kopfhalterarme anpassen.
3. Wechseln Sie zu den Wasserimmersionsobjektiven 25X 1,0 NA (numerische Apertur), 4 mm WD (Arbeitsabstand) oder 40X 0,8 NA, 3 mm WD. Füge genug entionisiertes Wasser hinzu, um die Kanüle zu füllen, und halte überschüssiges Wasser auf der Kanüle. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
4. Verwenden Sie Zwei-Photonen-Anregung (2P) und bilden Sie Fluoreszenzsignale ab.
   HINWEIS: Das Bildgebungsprotokoll hängt stark von den zu erfassenden Zeit- und Raumskalen ab. Weitere Informationen zu den Bildeinstellungen, die wir zur Erstellung der in diesem Artikel gezeigten Bilder verwendet haben, finden Sie in den repräsentativen Ergebnissen und Diskussionen des Abschnitts.

Ergebnisse

Materialien