Dieses Video zeigt eine Methode, um die Ursprünge sensorischer Neuronen in der Dura mater mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen. Ein retrograder Tracer wird in die exponierte Dura mater einer anästhesierten Ratte eingeführt. Der Tracer wird von sensorischen neuronalen Axonen aufgenommen und wandert retrograd zu ihren Zellkörpern innerhalb des Ganglion trigeminus und der dorsalen Ganglien der Halswirbelsäule. Die Ganglien werden dann geschnitten, mit Antikörpern gefärbt, die den Tracer und die Neuropeptide in den Zellkörpern markieren, und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie analysiert, um den ganglionären Ursprung der sensorischen Neuronen zu bestätigen.
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Methodenartikel
Untersuchung der Ursprünge sensorischer Neuronen in der Dura mater mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierarzt JoVE überprüft Prüfungsausschuss.1. Retrograde Tracing-Studie mit Fluorgold (FG)
- Chirurgische Eingriffe
- Bestimmen Sie den Koordinatenbereich von Interesse in der kranialen Dura mater der Ratte.
- Bereiten Sie eine 10-μl-Mikrospritze vor und testen Sie sie mit flüssigem Paraffin.
- Betäuben Sie die Ratten mit Tribromethanollösung (150 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Überprüfen Sie die Tiefe in der Anästhesie, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren.
- Rasieren Sie den Kopf der Ratte mit einem Elektrorasierer.
- Setzen Sie der Ratte stumpfe Ohrstangen auf und legen Sie sie auf das stereotaktische Gerät. Setzen Sie dann den Mundhalter auf und tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf.
- Reinigen Sie die Operationsstelle der Kopfhaut mit 10 % Povidon-Jod, gefolgt von 75 % Ethanol.
- Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut.
- Entfernen Sie das Periost und das Muskelgewebe mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze stumpf vom Schädel weg (Abbildung 1A).
- Bohren Sie ein kleines Loch (~5-7 mm) mit einem Fräser mit runder Spitze (#106) auf das linke Scheitel- und Schläfenbein oberhalb der mittleren Meningealarterie (MMA) und stellen Sie sicher, dass die kraniale Dura mater intakt geblieben ist (Abbildung 1B).
- Bauen Sie eine Bank um das Loch mit Zahnsilikatzement, um die Ausbreitung des Tracers zu begrenzen (Abbildung 1C).
- Geben Sie 2 μl 2% FG mit einer 10 μl Mikrospritze in das Loch um MMA (Figure 1D).
- Decken Sie das Loch mit einem kleinen Stück blutstillendem Schwamm ab.
- Legen Sie ein Stück Paraffinfilm auf das Loch und versiegeln Sie die Ränder mit Knochenwachs, um das Austreten von Tracer zu verhindern und eine Kontamination des umgebenden Gewebes zu vermeiden.
- Vernähen Sie die Wunde mit sterilem Faden.
- Halten Sie die Ratten an einem warmen Ort, bis sie sich vollständig erholt haben.
- Bringen Sie die Ratten zurück in ihre Käfige und geben Sie ein Antibiotikum und ein Schmerzmittel in das Trinkwasser.
- Perfusionen und Abschnitte
- Nach 7 Überlebenstagen, durchbluten Sie diese Ratten.
- Präparieren Sie das Ganglion trigeminus (TG) und die Spinalganglien C1-4 (DRGs), fixieren Sie sie dann und kryoschützen Sie sie (Abbildung 1F).
- Schneiden Sie die TG und DRGs in einer Dicke von 30 μm auf einem Kryostat-Mikrotomsystem in sagittaler Richtung und montieren Sie sie auf silanbeschichtete Objektträger.
- Doppelte Immunfluoreszenzen für die Markierung von FG- und Calcitonin-Gen-verwandten Peptiden (CGRP) in den TG- und DRGs
HINWEIS: Obwohl die FG-Markierung direkt mit ultravioletter (UV) Beleuchtung unter Quecksilberlampe ohne zusätzliche Färbung beobachtet werden kann, wurden die markierten Neuronen mit FG in TG und zervikalen DRGs unter Verwendung von Doppelimmunfluoreszenzen mit FG und CGRP weiter untersucht, um die Ursprünge der duralen CGRP-immunreaktiven Nervenfasern in den TG und DRGs.- Kreisen Sie die Abschnitte mit dem histochemischen Stift ein.
- Inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang in einer Blockierungslösung, die 3 % normales Eselsserum und 0,5 % Triton X-100 in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) enthält.
- Die Proben werden über Nacht bei 4 °C in die Lösung aus Kaninchen-Anti-Fluorgold (1:1000) und Maus-Anti-CGRP-Antikörper (1:1000) in 0,1 M PB mit 1 % normalem Eselsserum und 0,5 % Triton X-100 überführt.
- Waschen Sie die Abschnitte am nächsten Tag dreimal in 0,1 M PB.
- Inkubieren Sie in einer gemischten Lösung aus Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper Alexa Fluor 594 (1:500) und Esel-Anti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 488 (1:500) in 0,1 M PB, der 1 % normales Eselserum und 0,5 % Triton X-100 enthält, für 1,5 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Partien und kleben Sie sie mit Deckgläsern auf.
- Beobachtung und Aufzeichnung
- Nimm Bilder der FG-markierten Neuronen in TG und DRGs unter UV-Beleuchtung mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist.
- Nehmen Sie Bilder der FG- und CGRP-markierten Neuronen in TG und DRGs unter einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist.
- Verwenden Sie die Bearbeitungssoftware, um die Helligkeit und den Kontrast von Bildern anzupassen und Beschriftungen in den Bildern hinzuzufügen.
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Ergebnisse
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Brain stereotaxis instrument | |||
| CellSens Dimension | |||
| Fluorogold (FG) | |||
| Fluoreszierendes Bildgebungssystem | |||
| Freezing microtome | |||
| Micro Drill | |||
| Mouse anti-CGRP | |||
| Normales Eselserum | |||
| Phalloidin 568< | |||
| Photoshop und Illustration | |||
| Kaninchen Anti-Fluorogold | |||
| Sprague Dawley | |||
| Superfrost plus microscope slides |
