Überwachung der Gewinnung von laserablierten Interneuromastzellen im Zebrafisch mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Volpe, B. A.. , et al. Konfokalmikroskopischer Laserablations- und Regenerationsassay in Interneuromastzellen von Zebrafischen. J. Vis. exp.{TAG_ 31}} (2020)

Dieses Video zeigt die Überwachung der Regeneration von Interneuromastzellen im Zebrafisch mittels konfokaler Mikroskopie, die Verfolgung des Zelltods und der Reparatur durch Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung.

Protokoll

1. Post-Ablation Imaging und Zeitraffermikroskopie zur Untersuchung der Regeneration

1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü für "Kanäle". Deaktivieren Sie in Kanälen die Option "DAPI"(4′,6-Diamidino-2-phenylindol)-Spur zur Inaktivierung des Ablationslasers. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü für "Acquisition mode".
2. Klicken Sie im Erfassungsmodus auf "Zoom".
3. Verringern Sie den Zoom auf 0,7, indem Sie entweder den Schieberegler verwenden oder indem Sie "0.7<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>."
   1. Um eine erfolgreiche Zellablation zu gewährleisten, erhöhen Sie die Verstärkung auf 900 und scannen Sie das Sichtfeld schnell.
      NOTE: Es sollte kein GFP (grün fluoreszierendes Protein) in der Zielzelle(n) sichtbar sein. Erfassen und speichern Sie mit den gleichen oder ähnlichen Einstellungen wie bei der Abbildung vor der Ablation ein Bild nach der Ablation (Figure 1C). Wenn das Bild Reste von fluoreszierenden Zellen oder zusätzliche Zellkörper zeigt, die entfernt werden müssen, wiederholen Sie die Schritte der Laserablation, um eine sichtbare Lücke in der Kette der Interneuromastzellen zu schaffen.
   2. Untersuchen Sie das Kanalbild des T-PMT (Transmission Photomultiplier Tube), um die Zellschädigung weiter zu bestätigen. Beschädigte Zellen haben ein körniges Aussehen, und die Zellkerne schwellen häufig an oder werden unregelmäßig in ihrer Form (Abbildung 2).
4. Nachdem Sie ein Bild vor der Ablation aufgenommen, die Zellen bei Bedarf abgetragen und ein Bild nach der Ablation für jede einzelne Tischposition aufgenommen haben, richten Sie die Zeitraffermikroskopie ein, indem Sie sowohl die Tischposition als auch die Zeitoptionen für die Bildaufnahme aktivieren. Stellen Sie die Zeitparameter auf 24 h oder einen anderen gewünschten Endpunkt und 15-Minuten-Intervalle ein. Starten Sie das Experiment, um Bilder zu erfassen, und speichern Sie die resultierende Datei, wenn sie abgeschlossen ist (am nächsten Tag).
5. Wenn Larven weiter untersucht oder aufgezogen werden sollen, entfernen Sie sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus der Agarose und überführen Sie sie dann zur Gewinnung in E3-Medium ohne Tricain. Wenn sie nicht weiter verwendet werden sollen, euthanasieren Sie sie gemäß dem genehmigten Tierprotokoll (schnelles und anhaltendes Eintauchen in ein Eisbad ist eine gängige Methode) und entsorgen Sie sie gemäß den Anforderungen der Einrichtung.

Ergebnisse

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-well PTFE Printed Slides<	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricain in Umkehrosmosewasser
1X E3 + 600 μM Tricaine			Verdünnen Sie 15 mM Tricain-Aktien 25x in 1X E3-Medien
1X E3 media			Verdünnen Sie 60X E3-Medien auf 1X in Umkehrosmosewasser (16,7 ml/L)
60 X E3 media	Alle von Sigma-Aldrich gekauften Komponenten		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 Liter Umkehrosmosewasser
Bx60 Zusammengesetztes Mikroskop mit Quecksilberbogenlampen-Fluoreszenz<
LSM 700 Konfokalmikroskop mit 405 nm, 488 nm und 555 oder 561 nm Lasern	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Für die Ablation wurde ein 5 mW 405 nm Laser verwendet; Ablationen und Bildgebung wurden mit einem 63-fachen Plan-Apochromat-Objektiv mit einer NA von 1,40<
FIJI/ImageJ Bildverarbeitungssoftware	Mehrere Mitwirkende		Herunterladbar unter https://fiji.sc/
Präpariernadel in Haarmesser umgewandelt	Fisher Scientific<	Eine Wimper wurde auf das Ende einer Präpariernadel mit Holzgriff geklebt
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google Sheets ist eine kostenlose Alternative zu Microsoft Excel<
Glasboden 35 mm Schüsseln mit Deckglas Nr. 1,5, 20 mm Fenster	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm Petrischale, 20 mm Glasscheibe
Immersol 518F Immersion Oil<	12-624-66A
Low Gelling Agarose<	A9414-256<
Corning Netwell Einsatz mit 74 um Polyester Mesh, 24 mm Einsatz	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Herunterladbar unter https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereomikroskop	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC<

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