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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Prüfung überprüft und genehmigt <
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1.Vorbereiten Modifizierter Krebs-Puffer.
Stellen Sie einen modifizierten Krebs-Puffer so her, dass die endgültigen Konzentrationen (in mM) der Komponenten wie folgt sind: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1.2 MgCl2, 1.2 NaH2PO4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO3, 1 Brenztraubensäure und 8 Glukose (pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit NaOH). Fügen Sie 3 μM Nicardipin und 1 μM Scopolamin hinzu, um Muskelkontraktionen während Ca2+ Bildgebung und Whole-Mount-Dissektionen.
2. Bildgebung und Analyse
HINWEIS: Verwenden Sie mindestens ein grundlegendes Bildgebungs-Rig mit einer Fluoreszenzlichtquelle, einem Mikroskop, einer hochwertigen CCD-Kamera und geeigneter Aufnahmesoftware. Variieren Sie die Hinzufügung anderer Komponenten je nach Lichtquelle und spezifischer Anwendung. Ein Filterrad und ein Verschluss müssen mit einer herkömmlichen Xenon-Bogenlichtquelle verwendet werden. LED-Lichtquellen und Beleuchtungssysteme benötigen diese Komponenten jedoch nicht.
- Positionieren Sie die Aufnahmekammer unter dem Mikroskop und stellen Sie mit einem Schwerkraftfluss-Perfusionssystem mit mehreren beheizten Spritzenbehältern eine kontinuierliche Perfusionsrate von 2–3 ml/min von 37 °C Krebs-Puffer her. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen sowohl in der Eingangs- als auch in der Saugleitung bilden, die mit einer Vakuumfalle verbunden ist.
- Bringen Sie den gewünschten Plexus unter Hellfeldbeleuchtung in den Fokus. Vermeiden Sie eine Überbelichtung des Gewebes, die zu Photobleaching führen kann.
- Untersuchen Sie die Fluo-4-Belastung in den Ganglien und wählen Sie gesunde Ganglien für die Bildgebung aus. Ungesunde/beschädigte Ganglien weisen eine Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie auf und sollten nicht für die Bildgebung verwendet werden.
- Sobald das Ganglion ausgewählt ist, leiten Sie den Lichtweg zur Kamera um und erhalten Sie ein Live-Bild mit einer Bilderfassungssoftware. Stellen Sie sicher, dass das Ganglion scharf ist, und stellen Sie die Bildaufnahmerate und die Belichtungszeiten ein.
HINWEIS: Die Raten und Zeiten der Bildaufnahme variieren je nach den Ereignissen, die die Ermittler aufzeichnen möchten. Für die meisten Experimente werden Bilder traditionell bei 0,5-1 Hz für Gliazellen und bis zu 2-10 Hz für Neuronen aufgenommen, da glial Ca2+ Antworten sind nicht so schnell wie Ca2+ Transienten in Neuronen. - Starten Sie das Experiment und legen Sie die Basisaktivität für 30 Sekunden fest.
- Tragen Sie vorgewärmte Arzneimittel von Interesse wie Rezeptoragonisten und Antagonisten mit dem Schwerkraftfluss-Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml/min auf. Nach der Anwendung von Agonisten/Antagonisten kehren Sie zu einer Perfusion mit normalem Puffer zurück und warten Sie eine Wasch-/Erholungsphase von mindestens 10 Minuten.
NOTE: Die Anwendungszeiten des Medikaments variieren je nach Verbindung und Versuchsdesign. Im Allgemeinen reicht eine 20-30-sekundenlange Anwendung von Agonisten aus, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in Neuronen und Gliazellen zu aktivieren. Ligandengesteuerte Ionenkanäle (wie z. B. nikotinische Acetylcholinrezeptoren) erfordern jedoch Anwendungszeiten von nicht mehr als 5-10 Sekunden. Eine weitere Dauer der Exposition führt zu einer schnellen Desensibilisierung der ligandengesteuerten Ionenkanäle. Antagonisten sollten etwa 3-15 Minuten lang angewendet werden, um eine vollständige Blockade der Rezeptorwege zu gewährleisten. Dies ist jedoch eine grobe Verallgemeinerung, und Forscher sollten jedes experimentelle Medikament immer in ihrem speziellen Paradigma optimieren. - Stoppen Sie die Aufnahme und sehen Sie sich den Zeitrafferfilm des Experiments an. Wählen Sie mit der entsprechenden Bildanalysesoftware sorgfältig Bereiche von Interesse (ROIs) aus.
- Verwenden Sie Software, um die ROI-Fluoreszenzintensität zu normalisieren und mit dem anfänglichen Ausgangswert der Fluoreszenz zu vergleichen. Änderungen der normalisierten Fluoreszenz sind direkt proportional zu den Änderungen in [Ca2+].
- Verwenden Sie eine Modifikation einer zuvor beschriebenen Methode mit ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, wobei F1 die Fluoreszenz an einem bestimmten Punkt und F0 die Basislinienfluoreszenz ist, um die Bewertungsgenauigkeit zu verbessern. Diese Modifikation hilft bei der Reduzierung des Rauschens durch Fluoreszenzveränderungen in Gewebepräparaten, die eine Bewegung der Muskelschicht unter dem Plexus myentericus aufweisen.