Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs Iontophorese in einem fixierten Maushirnschnitt

Zusammenfassung

Quelle: Moye, S. L., et.al. Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe der luzifergelben Iontophorese. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoff-Iontophorese zur Untersuchung der Astrozytenmorphologie in fixierten Hirnschnitten. Es beschreibt das Durchstechen des Astrozyten-Somas mit einer Elektrode, um einen anionischen, hydrophilen Farbstoff unter einem Niederspannungsstrom in das Zytoplasma zu bringen, so dass der Farbstoff das Soma und die Äste diffundieren und markieren kann. Die konfokale Mikroskopie wird dann verwendet, um die markierten Astrozyten sichtbar zu machen und morphologische Einblicke zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Füllen von Astrozyten mit Iontophorese

1. Testen Sie die Elektrode.
   1. Legen Sie eine Gehirnscheibe vorsichtig in eine mit 0,1 M PBS gefüllte Glasbodenschale bei Raumtemperatur. Halten Sie die Scheibe mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode an eine Spannungsquelle angeschlossen ist, und legen Sie die Masseelektrode in das Bad, in dem sich die Hirnscheibe befindet.
   3. Verschieben Sie das Ziel in die Gehirnregion, die Sie interessiert.
   4. Senken Sie die Elektrode in die Lösung. Bewegen Sie es unter dem Hellfeld in die Mitte des Sichtfelds und untersuchen Sie es vorsichtig mit der 40-fachen Wasserimmersionslinse, um sicherzustellen, dass es klar und ohne Schmutz oder Blasen erscheint. Wenn die Elektrodenspitze verstopft ist, ersetzen Sie sie durch eine neue.
      HINWEIS: Verstopfung ist ein Problem für die 200-MΩ-Elektrode. Mit einer Zentrifugation und Filtration der Farbstofflösung vor jedem Experiment sollte dies kein häufiges Problem sein. Da die Spitze der Elektrode jedoch klein ist, kann es manchmal vorkommen, dass Gewebe in der Öffnung stecken bleibt. Die Autoren haben keinen Weg gefunden, dies zu verhindern, aber es kann einfach mit einer neuen Elektrode behoben werden.
   5. Senken Sie die Elektrode unter dem Hellfeld langsam in Richtung der Scheibe ab, die knapp über der Oberfläche stoppt.
2. Füllen Sie die Astrozyten mit Iontophorese.
   1. Identifizieren Sie Astrozyten 40-50 μm unter der Schnittoberfläche mit dem Infrarot-Differenzialinterferenzkontrast (IR-DIC). Suchen Sie nach Zellen mit länglichen, ovalen Spaltöffnungen mit einem Durchmesser von etwa 10 μm. Sobald ein Astrozyt ausgewählt ist, bewegen Sie ihn in die Mitte des Sichtfeldes.
      HINWEIS: Eine gute Zelle für die Iontophorese hat klare, definierte Grenzen um sich herum. Wählen Sie Zellen nicht zu nah an der Oberfläche des Slices, da sie nicht vollständig gefüllt werden können. Es braucht etwas Übung über ein paar Tage, um in der Lage zu sein, Astrozyten für die Farbfüllung routinemäßig zu identifizieren. Je nachdem, welches Hirnareal für das Experiment verwendet wird, kann die Anzahl der Astrozyten variieren. Dies kann sich auf die Zeit auswirken, die benötigt wird, um einen Astrozyten vor dem Befüllen zu identifizieren.
   2. Senken Sie die Elektrodenspitze langsam in die Scheibe ab und navigieren Sie durch das Gewebe, bis sie sich auf der gleichen Ebene wie der Zellkörper befindet.
      HINWEIS: Bewegen Sie die Elektrode langsam, um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden.
   3. Sobald der Zellkörper des Astrozyten deutlich sichtbar und umrissen ist, schieben Sie die Elektrode langsam und sanft nach vorne. Bewegen Sie die Elektrode, bis die Spitze das Soma der Zelle aufspießt. Bewegen Sie den Fokus des Objektivs langsam auf und ab, um festzustellen, ob sich die Elektrode im Soma befindet.
      HINWEIS: Die Elektrodenspitze muss sich im Zellkörper befinden, und es sollte eine kleine Vertiefung auf dem Soma beobachtet werden. Bewegen Sie die Elektrode nicht weiter, um zu vermeiden, dass die Spitze durch die Zelle geht.
   4. Sobald sich die Elektrodenspitze in der Zelle befindet, schalten Sie den Stimulator bei ~0,5-1 V ein und geben Sie kontinuierlich Strom in die Zelle ab. Beobachten Sie mit dem konfokalen Mikroskop, wie sich die Zelle füllt. Erhöhen Sie den Digitalzoom, um die Details der Zelle zu sehen, und stellen Sie sicher, dass die Spitze der Elektrode im Inneren der Zelle sichtbar ist.
      HINWEIS: Verringern Sie die Spannung, wenn es den Anschein hat, dass Farbstoff aus der Zelle austritt oder andere Zellen in der Nähe füllt. Wenn es den Anschein hat, dass immer noch Farbstoff aus der Zelle austritt, ziehen Sie die Elektrode langsam heraus und suchen Sie sich eine andere Zelle. Es ist wichtig, dass der Farbstoff nicht ausläuft, um ein hohes Signal-/Hintergrundverhältnis im endgültigen Bild zu haben.
   5. Warten Sie ca. 15 min, bis die feineren Verzweigungen und Prozesse definiert erscheinen, schalten Sie die Spannung aus und ziehen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig aus der Zelle.
3. Stellen Sie sich die gefüllte Zelle vor.
   HINWEIS: Die Bildgebung kann sofort nach dem Befüllen durchgeführt werden. Ein Objektiv mit einer höheren numerischen Apertur (NA) führt zu einer besseren Auflösung.
   1. Warten Sie, bis die Zelle in ihre ursprüngliche Form zurückkehrt, bevor Sie mit dem 40-fachen Objektiv (15-20 min) abbilden. Um die Zelle abzubilden, passen Sie die Einstellung an der Konfokalseite an, um sicherzustellen, dass die feineren Verzweigungen und Prozesse definiert erscheinen.
   2. Richten Sie einen Z-Stack mit einer Schrittweite von 0,3 μm ein. Bewegen Sie das Objektiv während der Bildgebung, bis kein Signal mehr von der Zelle zu hören ist, und stellen Sie diese als Oberseite ein. Bewegen Sie dann das Objektiv nach unten (Fokussierung durch die Zelle), bis kein Signal mehr vorhanden ist, und stellen Sie dies als Boden ein.

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