Dieses Video zeigt das Verfahren zum Einbetten der Drosophila Gehirn in einer Fibrinmatrix, gefolgt von einer Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung von Neuronen der zirkadianen Uhr, um die rhythmische Aktivität zu analysieren, die mit Hell-Dunkel-Zyklen synchronisiert ist.
Methodenartikel
Einbettung des Drosophila-Gehirns in eine Matrix für die Zeitraffer-Bildgebung der Neuronen der zirkadianen Uhr
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
- Einbettung von Hirnexplantaten in eine 3D-Matrix und Montage (~20 min).
- Tauchen Sie ein präpariertes Gehirn wie folgt in Fibrinogen-Arbeitslösung (Fibrinogen-Endkonzentration ~3,3 mg/ml, 10,5 μl pro Gehirn):
- Aspirieren Sie 3,5 μl Schneider-Aktivmedium (SAM)/Antibiotika. Aspirieren Sie ein präpariertes Gehirn aus der Dissektionsvertiefung in dieselbe Pipettenspitze, ohne das SAM/Antibiotika-Medium in die Spitze abzugeben.
- Geben Sie das Gehirn und das Medium auf den Deckel einer sterilen Petrischale. Geben Sie weitere 3,5 μl SAM/Antibiotika und 3,5 μl warme Fibrinogen/SAM 10 mg/ml-Lösung in den Tropfen, der das Gehirn enthält. Mischen Sie die Lösung vorsichtig um das Gehirn herum, indem Sie sie mit einer 20-μl-Pipettenspitze pipettieren.
HINWEIS: Die Verwendung einer Pipette anstelle einer Pinzette in diesem Schritt vermeidet eine Belastung des Gehirns. - Nehmen Sie 2 μl der Fibrinogen-Arbeitslösung aus dem Tropfen und tragen Sie sie als kleinen Kreis auf das Deckglas der Glasbodenschale auf. Fügen Sie 0,8 μl Thrombin hinzu und mischen Sie sehr schnell mit einer Pipettenspitze. Das Fibrinogen wird in Fibrin umgewandelt und beginnt zu polymerisieren.
- Nehmen Sie das Gehirn, das in der Fibrinogen-Arbeitslösung sitzt (Schritt 1.1) zwischen einer Pinzette und positionieren Sie es auf der Matrix, sobald eine weiße Matrix aus Fibrin sichtbar ist. Richten Sie das Gehirn mit der vorderen Seite nach unten aus (für die Abbildung von Uhrenneuronen). Schieben Sie es so nah wie möglich an das Deckglas. Das Fibringerinnsel besteht aus Schichten von Fibrin. Wählen Sie eine Schicht aus und falten Sie sie mit kleinen und sanften Bewegungen auf das Gehirn, ohne die Matrize abzulösen.
- Wiederholen Sie dies 2 bis 3 Mal von verschiedenen Teilen des Gerinnsels, um das Gehirn zu stabilisieren.
HINWEIS: Wenn Sie das Gehirn mit einer Zange anfassen, achten Sie darauf, es nicht auszutrocknen oder körperlich zu belasten.
- Wiederholen Sie dies 2 bis 3 Mal von verschiedenen Teilen des Gerinnsels, um das Gehirn zu stabilisieren.
- Geben Sie 20 μl SAM/Antibiotika auf das eingebettete Gehirn, um die Wirkung von Thrombin zu stoppen.
- Wiederholen Sie den Vorgang, um die restlichen Gehirne zu montieren. Bis zu fünf bis sechs Gehirne können in eine Glasbodenschale eingebettet werden.
- Für eine Langzeit-Live-Bildgebung geben Sie 600 μl SAM/Antibiotika in die innere Vertiefung (den Glasteil). Positionieren Sie eine vorgeschnittene Membran aus Polytetrafluorethylen (PTFE) auf dem Medium und kleben Sie sie auf das Vakuumfett, das auf den Kunststoffteil der Unterseite aufgetragen wird (Abbildung 1A).
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Ergebnisse
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | |||
| CaCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| D-(+) Glucose< | |||
| Yeast extract | |||
| Insulin | |||
| Penicillin-Streptomycin | |||
| BIS-TRIS | |||
| L-(−)-Apfelsäure | |||
| D-(+)-Trehalose-Dihydrat | |||
| Bernsteinsäure | |||
| Fumarsäure | |||
| α-Ketoglutarsäure | |||
| Nicht hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum (FCS) Mykoplasma und Virus gescreent | |||
| HEPES-KOH, pH 7.4 | |||
| KCl | |||
| NaH2PO4 | |||
| Saccharose | |||
| Fibrinogen aus Rinderplasma | VORSICHT: Gesundheitsschädlich durch Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Manipulieren unter laminar flow | ||
| Thrombin aus Rinderplasma | Sigma-Aldrich | ||
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | ||
| Vaccum grease | |||
| 35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 20 mm Glasdurchmesser, Unbeschichtet | MatTek | ||
| Corning Falcon Easy-Grip Gewebekulturschalen | |||
| Steriler 500 mL Steritop-GP 33 mm Flaschenaufsatzfilter, 0,22 μm | |||
| Polytetrafluorethylen (PTFE) Folie | |||
| Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 μm, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert | |||
| Millex-GV Spritzenfiltereinheit, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert | |||
| Zerlegeschale aus Glas | |||
| Feine Pinzette, Größe 5, Dumont | |||
| Tandem-Scanner invertiertes konfokales Mikroskop TCS SP5, mit resonantem Scanner und HyD-Photomultiplier-Detektoren | Leica microsystem CMS GmbH< | ||
| Temperaturkontrollkammer | Das CUBE & BOX Temperaturkontrollsystem, custom designed | ||
| Stage-top Feuchtigkeitsregler | |||
| Water Immersion Micro Dispenser: Dispenser, erweiterte Mikropumpe MP6-Serie und Autoimmersion Objective Controller Software | Leica microsystem CMS GmbH< | ||
| SUM-Stack-Erstellung und 3D-Korrekturdrift plugin | |||
| 10x iterative Dekonvolution | AutoQuant und Imaris software |
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