Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen aus Mausembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Bancroft, E. A., et al{. Quantifizierung spontaner Ca²⁺ Flüsse und ihre nachgelagerten Effekte in primären Mittelhirnneuronen der Maus. J. vis. exp. (2020)

{{TAG_ 46}}Dieses Video zeigt die Echtzeit-Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen, die aus Mausembryonen stammen. Unter Verwendung eines viralen Vektors zur Expression eines Kalziumindikators werden die Neuronen unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um Änderungen der Fluoreszenzintensität während der spontanen und Neurotransmitter-induzierten Kalziumaktivität zu verfolgen.

Protokoll

1. Beschichtung der Zellen

HINWEIS: Erfahrungsgemäß werden etwa 100.000 lebensfähige Zellen pro Embryo gesammelt. 2-3 Monate alte zeitlich trächtige Mäuse haben typischerweise eine Wurfgröße von 8-10 Embryonen; daher liegt eine grobe Schätzung für die Gesamtausbeute an Zellen pro zeitgesteuerter trächtiger Maus bei etwa 1 Million Zellen.

1. Führen Sie mit einem Hämozytometer eine Zellzählung durch und verdünnen Sie dann die Suspension mit Zellkulturmedium auf 2.000 Zellen/μl. Zum Mischen kurz trituieren.
2. Entnehmen Sie Deckgläser mit Lamininlösung aus dem Inkubator und saugen Sie die restliche Lamininlösung mit Hilfe eines Vakuums aus den beschichteten Deckgläsern ab. Schnell plattieren, um ein vollständiges Austrocknen der Deckgläser zu vermeiden. Pipettieren Sie 100 μl (2,0 x 10⁵ Zellen/Deckglas) auf jedes Deckglas und stellen Sie die Petrischalen für 1 h in einen 37 °C Inkubator.
3. Vorsichtig 3 mL Zellkulturmedium in jede Schale geben und wieder in den 37 °C Inkubator stellen. Das Preform-Halbmedium wechselt 2 Wochen lang 2 Mal pro Woche.

2. Infektion der Zellkultur bei 14 (Tagen in vitro) DIV mit Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren

1. Bereiten Sie für jedes Gericht 1 ml serumfreies DMEM-Medium mit 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x^{10 13} Titer)
vor
2. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus jeder Schale und ersetzen Sie es durch 1 ml serumfreies Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das hSyn-GCaMP6f enthält. Stellen Sie die Schalen für 1 h wieder in den 37 °C heißen Inkubator.
3. Aspirieren Sie das serumfreie Medium, das AAVs enthält, und ersetzen Sie es durch 3 ml Zellkulturmedium. Stellen Sie die Schalen wieder in den 37 °C heißen Inkubator. Wir haben festgestellt, dass eine 5-7-tägige AAV-Infektion ein ideales Niveau der GCaMP-Expression ermöglicht. Wechseln Sie während dieser Zeit der Virusinfektion weiterhin alle 2-3 Tage das Medium.

3. Konfokale Live-Bildgebung von Ca²⁺ zwischen 19 und 21 Tagen in vitro (DIV)

HINWEIS: Die Bildgebung kann zwischen 5 und 7 Tagen nach der Virusinfektion durchgeführt werden. Dies ist das ideale Fenster, um eine sichtbare Expression des Fluorophors in einem Bereich zu erreichen, der den Nachweis einer spontanen^Ca2+-Aktivität ermöglicht.

1. Vorbereitung von Aufzeichnungspuffern
   1. Um 1 l HEPES-Aufnahmepuffer herzustellen, fügen Sie hinzu: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-Glukose, 2,381 g 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 2 ml 1 M CaCl₂ Stammlösung und 500 μl 1 M MgCl₂ Stammlösung zu 800 ml steril destillierter H₂O. Bringen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4. Auf ein Endvolumen von 1 l bringen.
   2. Um 200 mL 20 μM Glutamat-Aufnahmepuffer herzustellen, verdünnen Sie 40 μL 100 mM Glutamat-Stammlösung in 200 mL HEPES-Aufnahmepuffer, wie oben beschrieben.
2. Konfokale Bildgebung
   1. Füllen Sie eine sterile 35 mm Petrischale mit 3 mL Aufnahmepuffer.
   2. Entferne eine 35 mm Petrischale mit infizierten Kulturen aus dem 37 °C Inkubator. Fassen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig den Rand eines Deckglases und geben Sie es schnell in die mit Aufnahmepuffer gefüllte Petrischale. Legen Sie das restliche Deckglas medium zurück in den 37 °C heißen Inkubator. Transportieren Sie die Schüssel mit dem Aufnahmepuffer zum Konfokalmikroskop.
   3. Starten Sie die Imaging-Software. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, während er initialisiert wird.
   4. Starten Sie die Peristaltikpumpe und platzieren Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer. Kalibrieren Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf 2 ml/min.
   5. Übertragen Sie das infizierte Deckglas aus der 35 mm Petrischale in das Aufnahmebad.
   6. Finde mit dem 10-fachen Wasserimmersionsobjektiv und Hellfeldlicht (BF) die Fokusebene und suche nach einer Region mit einer hohen Dichte an Neuronenzellkörpern. Wechseln Sie zum 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv und verwenden Sie BF-Licht, um die Probe neu zu fokussieren.
   7. Im Fenster "Farbliste" in FluoView wählen Sie AlexaFluor 488 aus und wenden Sie es an.
   8. AAV-Ausdrücke können variabel sein; um eine Überbelichtung und Photobleiche der Fluorophore zu verhindern, beginnen Sie daher mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Stellen Sie für den AlexaFluor 488-Kanal die Hochspannung (HV) auf 500, die Verstärkung auf 1x und den Offset auf 0 ein. Stellen Sie für die 488-Laserlinie die Leistung auf 5% ein. Um das effektive Volumen in der Z-Ebene zu vergrößern, erhöhen Sie die Lochblendengröße auf 300 μm. Verwenden Sie die Scanoption "Focus x2", um die Emissionssignale optimal an die Untersättigung anzupassen. Von hier aus können die Einstellungen angepasst werden, bis die ideale Sichtbarkeit jedes Kanals erreicht ist.
      HINWEIS: Um den gesamten Bereich der Ca2⁺-Flüsse mit GCaMP genau zu erfassen, passen Sie die HV- und Laserleistungseinstellungen an, um eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen, ohne den Detektor zu übersättigen.
   9. Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, verschieben Sie den Tisch, um einen Bereich mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Änderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz und des Fokus auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung anzeigen.
   10. Verwenden Sie das Werkzeug "Rechteck zuschneiden", um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Bildintervall von knapp 1 Sekunde erreichen kann. Dies ist notwendig, um das Bildintervall auf 1 Bild pro Sekunde einzustellen.
   11. Setze das "Intervall"-Fenster auf einen Wert von 1,0 und das "Num"-Fenster auf 600.
       HINWEIS: Um verschiedene Aufnahmepuffer zum gewünschten Zeitpunkt (300 s) zu liefern, ist es wichtig, die Latenz der Pumpe zu kalibrieren, um die neue Lösung in das Bad zu bringen. Dies hängt von der Perfusionsrate der Lösung (2 ml/min) und der Länge der Leitung ab, die zum Pumpen der Lösung verwendet wird.
   12. Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option "Zeit" und verwenden Sie dann die Scanoption "XYt", um die Bildgebung zu starten.
   13. Beobachten Sie den Fortschrittsbalken der Bildgebung und verschieben Sie die Leitung vom HEPES-Aufnahmepuffer in den 20 μM Glutamat-Aufnahmepuffer zum richtigen Zeitpunkt (z.B. wenn die Latenz der Pumpe so kalibriert ist, dass sie bei 60 s Lösung liefert, verschieben Sie die Leitung in den Glutamatpuffer bei 240 Bildern, um Glutamat bei 300 s zu liefern).
   14. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche Serie fertig und speichern Sie den fertigen T-Serienfilm. Fahren Sie mit der Perfusion von 20 μM Glutamat für weitere 5 Minuten fort, so dass die kultivierten Neuronen insgesamt 10 Minuten lang Glutamat ausgesetzt waren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Deckglas, das abgebildet werden soll.
   15. Nach der zusätzlichen 5-minütigen Exposition mit 20 μM Glutamat entfernen Sie das Deckglas aus dem Bad und legen Sie es wieder in die 35-mm-Petrischale mit dem Aufnahmepuffer, bis der Tag der Bildgebung abgeschlossen ist.

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