Dieses Video zeigt den Einsatz von Fluoreszenzbildgebung zur Messung des zytosolischen Kalziumspiegels in kurz- und langfristigen Hippocampuskulturen von Ratten. Durch den Vergleich junger und gealterter Neuronen wird hervorgehoben, wie eine erhöhte spannungsgesteuerte Kalziumkanaldichte vom L-Typ und eine verlängerte Aktivierung in gealterten Neuronen zu einer Kalziumüberlastung führen, einem Kennzeichen der neuronalen Alterung. Fluoreszierende Kalziumindikatoren zeigen diese Unterschiede durch Änderungen der Fluoreszenzintensität bei Stimulation.
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Methodenartikel
In-vitro-Calcium-Bildgebung in Kurzzeit- und Langzeitkulturen des Hippocampus von Ratten
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Kurz- und langfristige Kultur der Ratten-Hippocampus-Neuronen
- Vorbereitung von Poly-D-Lysin-beschichteten, 12 mm Glasdeckgläsern.
- Sterilisieren Sie Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm mindestens 24 Stunden lang in Ethanol und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen trocknen.
- Verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen Parafilm in einer Petrischale. Bedecken Sie die Oberfläche jedes Deckglases mit 200 μl 1 mg/ml Poly-D-Lysin. Lassen Sie die Behandlung über Nacht (O/N) zu.
- Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Tag alle 15 Minuten 90 Minuten lang unter sterilen Bedingungen alle 15 Minuten mit doppelt destilliertem sterilem Wasser.
- Füllen Sie eine Mehrfachplatte mit vier Vertiefungen mit 500 μl Neurobasalem Kulturmedium pro Vertiefung. Neurobasales Kulturmedium sollte mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 % B27, 1 μg/ml Gentamicin und 2 mM L-Glutamin ergänzt werden.
- Legen Sie die Deckgläser auf die Multidish-Platte. Pflegen Sie sie in einer befeuchteten Temperatur von 37 ºC und 5% CO2 Inkubator bis zur Verwendung.
- Isolierung von Hippocampus-Neuronen aus neugeborenen Ratten.
- Bereiten Sie 1,8 ml Papain-Lösung (direkt gekauft) in einem Fläschchen (20 μl/ml) unter sterilen Bedingungen zu: Um eine Endkonzentration von 20 μl/ml zu erhalten, fügen Sie etwa 40 μl Papain in 1,8 ml Hank's plus 0,6% Rinderserumalbumin hinzu (BSA, μl sollte je nach Lieferantenbedingungen berechnet werden). Hank's 0,6% BSA wird durch Mischen von 85 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Medium mit 15 ml 4% Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt unter Auflösung von 4 g BSA in 100 ml HBSS) hergestellt. Bereiten Sie es in einer sterilen Haube zu.
- Inkubieren Sie das Papain vor Gebrauch 30 Minuten lang bei 37 ºC in Hank's plus 0,6 % BSA. Filtern Sie die Lösung vor der Verwendung mit einem 0,22-μm-Filter.
- Bereiten Sie Ham's F-12 Medium zu, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle's Medium Pulver (13,5 g pro l) in 900 ml doppelt destilliertes steriles Wasser geben. Fügen Sie dann 6 g 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) und 336 mg NaHCO3 und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH 4 N auf 7,42 ein. Fügen Sie steriles Wasser hinzu, um eine 1-l-Lösung zu erhalten, und filtern Sie sie mit einem 0,20 μm Polyethersulfon (PES)-Flaschenaufsatzfilter. Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube durch. Zum Schluss sättigen Sie die Lösung mit CO2. Lagern Sie die Lösungen bei 4 ºC und verwenden Sie sie gekühlt.
- Neugeborene (P0) Rattenwelpen durch Enthauptung einschläfern und den Kopf in sterilem HBS-Medium waschen. Öffnen Sie den Schädel mit Hilfe einer sterilen Schere. Entnehmen Sie das Gehirn mit einem Spatel und waschen Sie es schnell in Hams F-12 Medium.
- Machen Sie einen diagonalen Schnitt mit Hilfe eines Skalpells in jeder Hemisphäre (Figure 1B) und tragen Sie es zu einer Petrischale, in der sich Hams F-12-Medium befindet.
- Entsorgen Sie Hirnhäute vorsichtig mit Hilfe einer Präparierzange und unter einer Lupe.
- Identifizieren Sie den Hippocampus an einer charakteristischen konkaven Stelle über dem Kortex mit einer Lupe. Trennen Sie dann den Hippocampus von der Hirnrinde, indem Sie vorsichtig an einer Grenze ziehen und ihn mit einer Augenschere aus seiner Position entfernen.
- Übertragen Sie das Hippocampus-Gewebe auf eine 4-Well-Platte, die mit sterilem Hank's Medium gefüllt ist. Ca2+ und Mg2+ plus 0,6% BSA und waschen Sie Hippocampusgewebe. Schneiden Sie, ohne das Medium zu entfernen, das Gewebe mit derselben Augenschere in kleine Stücke (ca. 2 x 2 mm).
- Hippocampusstücke in ein Fläschchen mit 1,8 ml vorfiltrierter Papainlösung geben. Dann inkubieren Sie sie bei 37 ºC unter gelegentlichem, leichtem Schütteln. 15 min später 90 μl DNase I-Lösung (50 μg/ml final) zugeben und weitere 15 min inkubieren.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Fragmente mit frischem Neurobasal-Kulturmedium. Erhalten Sie eine Zellsuspension, indem Sie Gewebefragmente durch eine 5-ml-Kunststoffpipette führen.
- Zentrifugieren Sie die Zellensuspension bei 160 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette aus Kunststoff und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer automatisierten 1-ml-Pipette in 1 ml Neurobasal-Kulturmedium.
- Messen Sie die Zelldichte mit einer Neubauer-Zählkammer. Legen Sie das Glasdeckglas über die Neubauer-Kammer. 10 μl Zellsuspension zugeben. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension gleichmäßig in die Kammer eintritt und keine Blasen bildet. Zählen Sie die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop und führen Sie entsprechende Berechnungen durch, um einen geeigneten Tropfen von 40-80 μl mit 30 x 103 Zellen. Die Gesamtzahl der Zellen hängt von der Anzahl der verwendeten Tiere ab.
- Kurz- und Langzeitkultur von Hippocampus-Neuronen der Ratte.
- Über der Vier-Well-Multidish-Platte mit 500 μl Neurobasal-Kulturmedium, die zuvor vorbereitet und im Inkubator aufbewahrt wurde, Platte etwa 30 x 10<span style='font-family:Arial,sans-serif; Schriftgröße:0.6em; font-style:normal; font-variant:normal; Schriftstärke:400; text-dekoration:keine; vertical-align:Grundlinie; white-space:pre-wrap;' >3 Zellen in einem Tropfen von etwa 50 μl in jede Vertiefung der Multidish-Platte, die ein Poly-D-Lysin-beschichtetes Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 12 mm enthält.
- Pflegen Sie die primären Hippocampuszellen in einer befeuchteten Temperatur von 37 ºC und 5% CO2Inkubator für 2-5 Tage in vitro (DIV, Kurzzeitkulturen, junge Kulturen) oder >15 DIV (Langzeitkulturen, gealterte Kulturen) vor Experimenten ohne Wechsel des Kulturmediums.
2. Fluoreszenzbildgebung von zytosolischem Ca2+ Concentration
- Aufbereitung von Testlösungen für die Fluoreszenzbildgebung.
- Bereiten Sie eine externe HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) vor, die in mM enthält: NaCl 145, KCl 5, MgClarabische Ziffer 1, CaCl2 1, Glukose 10, Natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
- Bereiten Sie ein externes Mg2+-freie, HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) enthaltend, in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, Glukose 10 und HEPES 10 (pH 7.42).
- Löse N-Methyl-D-aspartat (NMDA) in Mg2+-freie, HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) in einer Endkonzentration von 100 μM und ergänzen Sie diese mit 10 μM Glycin.
- Bereiten Sie eine HBS-Lösung vor, die KCl anstelle von NaCl enthält, indem Sie (in mM) Folgendes lösen: KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, Glukose 10 und HEPES 10 (pH 7,42).
- Beladung von Hippocampuszellen mit der fluoreszierenden Kalziumsonde fura2/AM.
- Nehmen Sie die Zellkultur, die Deckgläser enthält, aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit HBS-Medium bei Raumtemperatur (RT), indem Sie sie auf eine neue Vier-Well-Multidish-Platte mit 500 μl HBS pro Vertiefung übertragen.
- Inkubieren Sie Zellen mit Fura2/AM 4 μM (hergestellt im gleichen HBS-Medium) für 60 min bei RT (25 ºC) an einem dunklen Ort.
- Nach 60 Minuten die Deckgläser mit frischem HBS Medium waschen.
- Aufnahme von Fluoreszenzbildern von zytosolischen [Ca2+] in kultivierten Zellen.
- Schalten Sie die Lampe, das Mikroskop, das Perfusionssystem, die Fluoreszenzkamera und den Computer ein.
- Legen Sie die Deckgläser in eine thermostatisierte Plattform für offene 12-mm-Glasdeckgläser auf den Tisch des inversen Mikroskops und wählen Sie mit einem 40-fach-Objektiv (Öl, numerische Apertur [NA]:1,3) ein mikroskopisches Feld aus. Die Zellen werden kontinuierlich mit vorgewärmtem (37 ºC) HBS-Medium in Abwesenheit oder Gegenwart von Prüfsubstanzen durchblutet. Halten Sie den Durchfluss bei einer Geschwindigkeit von ca. 5-10 ml/min.
Note: Zellperfusionssystem für lebende Zellen ist in einer thermostatisierten Plattform für offene 12 mm Glasdeckgläser montiert. Für die Perfusion der Lösungen wird ein 8-Leitungs-Perfusionssystem verwendet, das mit einer Ventilsteuerung ausgestattet ist. Eine Vakuumpumpe ist für die Entfernung des überschüssigen Mediums verantwortlich. Die Erwärmung der Lösungen erfolgt über eine Rohrheizung. - Nehmen Sie ein Hintergrundbild mit geschlossenem Verschluss bei beiden Anregungswellenlängen auf.
- Epi-illuminieren die Zellen abwechselnd bei 340 und 380 nm. Nehmen Sie Licht auf, das alle 5-10 Sekunden bei 520 nm emittiert wird, mit einer Fluoreszenzkamera, die durch einen dichroitischen Fura-2-Spiegel gefiltert wird.
- Wenn der Aufnahmezeitraum abgelaufen ist, speichern Sie die gesamte Sequenz der bei 520 nm emittierten Bilder zur weiteren Analyse auf dem Computer.
- Analyse von aufgenommenen Fluoreszenzbildern.
- Öffnen Sie die Experimentdatei. Klicken Sie in der aquacosmos-Software auf "Verhältnis" und wählen Sie den gewünschten Verhältnisbereich aus. Berechnen Sie das Pixel-für-Pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Abfolge von Verhältnisbildern zu erhalten.
- Subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie die "Hintergrundeliminierung" anpassen. Drücken Sie auf "Berechnung starten".
- Drücken Sie die Schaltfläche "All Times Sequence" und löschen Sie die alten Regions of Interest (ROIs). Für die quantitative Analyse einzelner Zellen können Sie neue Regions of Interest oder ROIs festlegen, die einzelnen Neuronen entsprechen. Mittelwerten Sie alle Verhältniswerte in jedem Pixel, die jedem ROI und jedem Bild entsprechen, um eine Aufzeichnung der Verhältnisfluoreszenzwerte für einzelne ROIs (Zellen) zu erhalten.
- Um die einzelnen Aufnahmen grafisch darzustellen, exportieren Sie die Fluoreszenzwerte des Verhältnisses, die jedem ROI entsprechen, in ein Grafikprogramm.
- Führen Sie die entsprechenden Berechnungen zur Abschätzung der Größe des Anstiegs der Fluoreszenz im Verhältnis zu jeder Stimulation mit einer geeigneten Datenanalyse- und Grafiksoftware durch.
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Ergebnisse
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Neurobasal Culture Medium | |||
| HBSS medium | |||
| Ham's F-12 medium | |||
| DNase I (aus Rinderbauchspeicheldrüse) | |||
| Fetal Bobine Serum | |||
| B27 | |||
| Gentamicin | |||
| L-glutamine | |||
| 12 mm glass coverslips | |||
| Papain | |||
| 4-well multidish plaques | |||
| Petri dishes | |||
| Sterile Pipetten | |||
| Fura2-AM< | |||
| Lipofectamine2000< | |||
| NMDA | |||
| Glycine | |||
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | |||
| Xcite ilumination system | |||
| ORCA ER fluorescence camera | |||
| VC-8 Ventilsteuerung | |||
| SH-27B Heizung system | |||
| Aquacosmos Software< |
