Bildgebung von Amyloid-beta-Plaques in Hirngewebeschnitten durch Immunmarkierung und Curcumin-Färbung

Zusammenfassung

Quelle: Maiti, P. et. al.,. Markierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Hirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin. J. vis. exp. (2019)

{{}}Dieses Video zeigt das bildgebende Verfahren von Amyloid-Beta-Plaques in Hirngewebeschnitten mittels Immunmarkierung und Curcumin-Färbung. Die Immunmarkierung sorgt für Spezifität für Amyloid-beta, während Curcumin selektiv β-Blatt-reiche Fibrillen bindet, was die Visualisierung verbessert. Die Kolokalisation von roter und grüner Fluoreszenz bestätigt das Vorhandensein von Plaques.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierarzt JoVE überprüft <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>                                                                  

1. Perfusion der Tiere

1. Bereiten Sie das Fixiermittel und die Perfusionspuffer vor.
   1. Bereite 0,1 M Natriumphosphatpuffer vor, indem du 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 21,7 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) und doppelt destilliertes Wasser, um insgesamt 1 L zu erhalten.
   2. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) vor.
      1. Füge 40 g Paraformaldehyd zu 1 L phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu (0,1 M, pH 7,4).
      2. Die PFA-Lösung auf 60–65 °C erhitzen und mit einem Magnetrührer mischen.
         HINWEIS: Die Die Temperatur sollte 65 °C nicht überschreiten.
      3. Geben Sie einige Tropfen Natriumhydroxid (NaOH) (1 N) mit einer Pipette hinzu, um das PFA vollständig aufzulösen.
      4. Die PFA-Lösung mit mittlerem bis feinem Filterpapier filtrieren und bei 4 °C lagern.
         HINWEIS: Die Die Lösung ist einen Monat lang haltbar.
2. Führen Sie Tieranästhesie und Perfusion durch.
   NOTE: Zwölf Monate alte B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x familiäre Alzheimer-Krankheit (5×FAD)) altersgleiche Kontrollmäuse (n = 6 pro Gruppe) wurden von Anbietern gekauft und im Tierhaus der Saginaw Valley State University gezüchtet. Die Genotypisierung wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestätigt. Human Alzheimer-Krankheit (AD) Hirngewebe umfasst postmortales AD-Hirngewebe und altersangepasstes Kontrollgewebe.
   1. Betäuben Sie das Tier mit einem geeigneten Betäubungsmittel, wie z.B. Natrium-Pentobarbital (390 mg/kg Körpergewicht) oder einem Ketamin/Xylazin-Gemisch (bis zu 80 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 G Nadel und 1 ml Spritze). Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie einen Zeh einklemmen. Wenn das Tier nicht ansprechbar ist, ist es bereit für eine Perfusionsoperation.
   2. Legen Sie das anästhesierte Tier in Rückenlage auf das Perfusionstablett und machen Sie mit einer kleinen Irisschere einen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels.
   3. Führen Sie eine 22-G-Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und machen Sie einen kleinen Schnitt an der rechten Ohrmuschel, um die Perfusionsflüssigkeit aus dem Körper zu entfernen. Verwenden Sie ein Schwerkraft-Perfusionssystem, um die eiskalte Perfusionsflüssigkeit (0,1 M PBS, pH 7,4) 5-6 min lang fließen zu lassen (Durchflussrate 20-25 ml/min).
      HINWEIS: A klar Die Leber ist der Indikator für eine optimale Durchblutung.
   4. Schalten Sie das Pufferventil zum Fixieren auf eine eiskalte 4%ige Paraformaldehydlösung um und lassen Sie es 8-10 Minuten lang fließen.
      NOTE: Tremor, gefolgt von verhärteten oder steifen Gliedmaßen, ist ein Indikator für eine gute Fixierung.
   5. Entfernen Sie das Gehirn mit einer Schere aus dem Schädel. Entnehmen Sie das Gehirn mit einem Spatel und legen Sie es in ein Fläschchen mit 4 % PFA (mindestens das 10-fache des Gehirnvolumens) und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.

2. Gewebeverarbeitung

1. Schneiden Sie Kryostat-Abschnitte.
   1. Übertragen Sie das Gehirn in abgestufte Saccharoselösungen (10%, 20% und 30%) und lagern Sie es bei 4 °C für jeweils 24 Stunden, bis zur Verwendung.
   2. Schneiden Sie mit einem Kryostaten bei -22 °C 40 μm dicke Abschnitte. Sammeln Sie 10-20 Schnitte pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte, die mit PBS und Natriumazid (0,02 %) gefüllt ist.

3. colocalize cur(curcumin) mit dem Aβ Antikörper in Aβ-Plaques und Oligomeren.

1. Waschen Sie Kryostat-Abschnitte aus Schritt 2.1.2 mit PBS 3x in einer 12-Well-Platte.
2. Blockieren Sie die Schnitte mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS), gelöst in PBS mit 0,5 % Triton-X-100, bei Raumtemperatur für 1 h.
3. Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Die Schnitte werden mit Amyloid-beta (Aβ)-spezifischen Antikörpern (6E10 oder A11, 1:200 verdünnt) inkubiert, die in einer frischen Blockierungslösung mit 10 % NGS und 0,5 % Triton-X100 über Nacht bei 4 °C in einem Shaker bei 150 U/min gelöst wurden.
4. Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Schnitte mit PBS 3x für jeweils 10 min.
5. Inkubieren Sie mit dem sekundären Antikörper-Tag mit rotem Fluorophor (z. B. Alexa
6. 594) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
7. 3x mit PBS für jeweils 10 min waschen.
8. 1x mit 70% Alkohol waschen.
9. Inkubieren Sie die Schnitte mit Curcumin (Cur (10 μM)) für 5 min bei Raumtemperatur.
10. 3x je 1 min mit 70% Alkohol waschen.
11. Dörren Sie jeweils 1 Minute lang mit 90% und 100% Alkohol, reinigen Sie ihn 2x lang mit Xylol und montieren Sie ihn auf Folien mit distyrene plasticizer xylole (DPX).
12. Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern für die roten und grünen Signale.

Materialien