{{}}Dieses Video zeigt das bildgebende Verfahren von Amyloid-Beta-Plaques in Hirngewebeschnitten mittels Immunmarkierung und Curcumin-Färbung. Die Immunmarkierung sorgt für Spezifität für Amyloid-beta, während Curcumin selektiv β-Blatt-reiche Fibrillen bindet, was die Visualisierung verbessert. Die Kolokalisation von roter und grüner Fluoreszenz bestätigt das Vorhandensein von Plaques.
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Methodenartikel
Bildgebung von Amyloid-beta-Plaques in Hirngewebeschnitten durch Immunmarkierung und Curcumin-Färbung
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
<
p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierarzt JoVE überprüft <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>1. Perfusion der Tiere
- Bereiten Sie das Fixiermittel und die Perfusionspuffer vor.
- Bereite 0,1 M Natriumphosphatpuffer vor, indem du 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 21,7 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4·7H2O), 2,59 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) und doppelt destilliertes Wasser, um insgesamt 1 L zu erhalten.
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) vor.
- Füge 40 g Paraformaldehyd zu 1 L phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu (0,1 M, pH 7,4).
- Die PFA-Lösung auf 60–65 °C erhitzen und mit einem Magnetrührer mischen.
HINWEIS: Die Die Temperatur sollte 65 °C nicht überschreiten. - Geben Sie einige Tropfen Natriumhydroxid (NaOH) (1 N) mit einer Pipette hinzu, um das PFA vollständig aufzulösen.
- Die PFA-Lösung mit mittlerem bis feinem Filterpapier filtrieren und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Die Die Lösung ist einen Monat lang haltbar.
- Führen Sie Tieranästhesie und Perfusion durch.
NOTE: Zwölf Monate alte B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x familiäre Alzheimer-Krankheit (5×FAD)) altersgleiche Kontrollmäuse (n = 6 pro Gruppe) wurden von Anbietern gekauft und im Tierhaus der Saginaw Valley State University gezüchtet. Die Genotypisierung wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestätigt. Human Alzheimer-Krankheit (AD) Hirngewebe umfasst postmortales AD-Hirngewebe und altersangepasstes Kontrollgewebe.- Betäuben Sie das Tier mit einem geeigneten Betäubungsmittel, wie z.B. Natrium-Pentobarbital (390 mg/kg Körpergewicht) oder einem Ketamin/Xylazin-Gemisch (bis zu 80 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg/kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 G Nadel und 1 ml Spritze). Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie einen Zeh einklemmen. Wenn das Tier nicht ansprechbar ist, ist es bereit für eine Perfusionsoperation.
- Legen Sie das anästhesierte Tier in Rückenlage auf das Perfusionstablett und machen Sie mit einer kleinen Irisschere einen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels.
- Führen Sie eine 22-G-Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein und machen Sie einen kleinen Schnitt an der rechten Ohrmuschel, um die Perfusionsflüssigkeit aus dem Körper zu entfernen. Verwenden Sie ein Schwerkraft-Perfusionssystem, um die eiskalte Perfusionsflüssigkeit (0,1 M PBS, pH 7,4) 5-6 min lang fließen zu lassen (Durchflussrate 20-25 ml/min).
HINWEIS: A klar Die Leber ist der Indikator für eine optimale Durchblutung. - Schalten Sie das Pufferventil zum Fixieren auf eine eiskalte 4%ige Paraformaldehydlösung um und lassen Sie es 8-10 Minuten lang fließen.
NOTE: Tremor, gefolgt von verhärteten oder steifen Gliedmaßen, ist ein Indikator für eine gute Fixierung. - Entfernen Sie das Gehirn mit einer Schere aus dem Schädel. Entnehmen Sie das Gehirn mit einem Spatel und legen Sie es in ein Fläschchen mit 4 % PFA (mindestens das 10-fache des Gehirnvolumens) und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
2. Gewebeverarbeitung
- Schneiden Sie Kryostat-Abschnitte.
- Übertragen Sie das Gehirn in abgestufte Saccharoselösungen (10%, 20% und 30%) und lagern Sie es bei 4 °C für jeweils 24 Stunden, bis zur Verwendung.
- Schneiden Sie mit einem Kryostaten bei -22 °C 40 μm dicke Abschnitte. Sammeln Sie 10-20 Schnitte pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte, die mit PBS und Natriumazid (0,02 %) gefüllt ist.
3. colocalize cur(curcumin) mit dem Aβ Antikörper in Aβ-Plaques und Oligomeren.
- Waschen Sie Kryostat-Abschnitte aus Schritt 2.1.2 mit PBS 3x in einer 12-Well-Platte.
- Blockieren Sie die Schnitte mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS), gelöst in PBS mit 0,5 % Triton-X-100, bei Raumtemperatur für 1 h.
- Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Die Schnitte werden mit Amyloid-beta (Aβ)-spezifischen Antikörpern (6E10 oder A11, 1:200 verdünnt) inkubiert, die in einer frischen Blockierungslösung mit 10 % NGS und 0,5 % Triton-X100 über Nacht bei 4 °C in einem Shaker bei 150 U/min gelöst wurden.
- Entsorgen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Schnitte mit PBS 3x für jeweils 10 min.
- Inkubieren Sie mit dem sekundären Antikörper-Tag mit rotem Fluorophor (z. B. Alexa
- 594) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- 3x mit PBS für jeweils 10 min waschen.
- 1x mit 70% Alkohol waschen.
- Inkubieren Sie die Schnitte mit Curcumin (Cur (10 μM)) für 5 min bei Raumtemperatur.
- 3x je 1 min mit 70% Alkohol waschen.
- Dörren Sie jeweils 1 Minute lang mit 90% und 100% Alkohol, reinigen Sie ihn 2x lang mit Xylol und montieren Sie ihn auf Folien mit distyrene plasticizer xylole (DPX).
- Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern für die roten und grünen Signale.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ein Tiermodell der Alzheimer-Krankheit< | |||
| Absoluter Alkohol | |||
| Alexa 594< | |||
| Antikörper 6E10< | |||
| Antikörper A11 | |||
| Cryostat | |||
| Curcumin | |||
| Dinatriumhydrogenphosphat | |||
| Dystyrene Weichmacher Xylol | |||
| Filter papers | |||
| Inverses Fluoreszenzmikroskop | Leica DMI 6000B | ||
| Inverses Fluoreszenzmikroskop | |||
| Normales Ziegenserum< | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Kaliumchlorid | |||
| Kaliumdihydrogenphosphat | |||
| Natriumazid | |||
| Sodium chloride | |||
| Sodium hydroxide | |||
| Natrium-Pentobarbital | |||
| Triton-X-100< | |||
| Xylole |
