Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität in einer Maus mit Hilfe der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

Abstract

Quelle: Jongbloets, B. C., et al{. Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität bei mäusen, die sich am Kopf fixiert verhalten mit Hilfe der In-vivo-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie. (2019)

Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopieverfahren zur Visualisierung der Proteinkinase-A-Aktivität in kopffixierten, sich verhaltenden Mäusen während der erzwungenen Fortbewegung.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. In Vivo Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

1. Beginnen Sie mit der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung (2pFLIM) Bildgebung 2 Wochen nach der Installation des Schädelfensters. Minimieren Sie experimentelle Interferenzen aufgrund von Stress durch häufiges Hantieren und Schrumpfen der Maus vor Beginn der Bildgebungsstudie, um die Maus daran zu gewöhnen.
2. Stellen Sie die Wellenlänge des Zwei-Photonen-Anregungslasers mit der Software, die den Zwei-Photonen-Laser steuert, auf 960 nm ein.
3. Betäuben Sie die Maus mit 4% Isofluran. Bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie, indem Sie den Schwanz zusammenklemmen und die Atemfrequenz beobachten. Das heißt, es sollte keine Reaktion auf das Einklemmen des Schwanzes geben und die Atemfrequenz sollte auf ~1 Atemzug pro Sekunde reduziert werden. Um unnötige Eingriffszeiten zu minimieren und da die Narkose nur zwei bis drei Minuten dauert, wird auf Augengleitmittel verzichtet.
4. Übertragen Sie die betäubte Maus auf das motorisierte Laufband (Figure 1C) und montieren Sie die Kopfplatte der Maus an der Kopfplattenhalterung des Laufband-Setups (siehe Abbildung 1 für Details). Reinigen Sie die Oberfläche der kranialen Fensterabdeckung an der Maus mit 70% Ethanol.
5. Platzieren Sie das motorisierte Laufband mit der montierten Maus unter dem 2pFLIM-Objektiv. Tragen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen dem Schädelfensterdeckglas und dem Objektiv auf.
6. Lassen Sie die montierte Maus mindestens 10 Minuten lang aus der Narkose erwachen und sich an die Umgebung des Laufbandes und des Mikroskops gewöhnen. Überwachen Sie die Atemfrequenz der Maus, während die montierte Maus aus der Narkose aufwacht.
7. Navigieren Sie unter Epi-Illumination zur Injektionsstelle. Dokumentieren Sie Passermarkenmerkmale (d. h. Blutgefäße) unter Hellfeld, um die Bildgebung derselben Region of Interest (ROI) bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu unterstützen.
8. Eliminieren Sie jegliches einfallende Licht, das nicht vom Gehirngewebe emittiert wird. Schalten Sie die Epi-Illumination-Lichtquelle aus und schließen Sie das Gehäuse des 2pFLIM-Rigs. Aktivieren Sie den 2pFLIM PMT, indem Sie die Hardware-Befehlsspannungsregelung einschalten.
9. Erfassen Sie ein 2pFLIM-Bild des Z-Stapels mit der 2pFLIM-Erfassungssoftware FLIMimage mit den folgenden empfohlenen Einstellungen für die Bildgebung von tAKARα-positiven Somata bei wachen Mäusen. Stellen Sie die Bildmittelung auf 3 Bilder, die Scangeschwindigkeit auf 2 ms/Zeile, die Bildgröße auf 128 x 128 Pixel und das Sichtfeld auf 90-100 μm ein. Passen Sie die Imaging-Einstellungen basierend auf der Vorbereitung und Hardwarekonfiguration an.
10. Prüfen Sie das aufgenommene Bild in der FLIM-Ansicht (eigenentwickelte kundenspezifische Software). Passen Sie die Bildgebungseinstellungen nach Schritt 1.9 an, um die Photonenzahl zu optimieren und das Photobleichen zu minimieren.

HINWEIS: Eine praktikable integrierte Photonenzahl in einem ROI für die lebenslange Abbildung eines tAKARα-positiven Somas in vivo beträgt ~1.000-10.000 Photonen, abhängig von der Signalamplitude, die sich aus einem bestimmten Stimulus ergibt.

1. Verwenden Sie ein verringertes Sichtfeld, eine verringerte Scangeschwindigkeit, eine erhöhte Laserleistung und eine erhöhte Anzahl von zu mittelnden Frames, um die Anzahl der integrierten Photonen zu erhöhen und den Fehler bei der Lebensdauerschätzung zu reduzieren. Achten Sie gleichzeitig darauf, die minimale erforderliche Laserleistung, die Bildmittelung und die Scangeschwindigkeit zu verwenden, um das Photobleaching zu minimieren.
2. Bilde in einem regelmäßigen Zeitintervall (z. B. alle 30-60 s), indem du die Z-Stack-Erfassung mit den in Schritt 1.10 festgelegten Einstellungen wiederholst. Nehmen Sie mindestens 15 Minuten lang 2pFLIM-Basisbilder bei null Laufbandgeschwindigkeit auf.
3. Stellen Sie die Rotationsgeschwindigkeit des Laufbandes 15 Minuten lang auf ~15 cm/s ein, während Sie 2pFLIM-Bilder aufnehmen. Setzen Sie die Bildgebung für ≥20 Minuten nach dem Ausschalten der Laufbanddrehung fort, um die Dauer der PKA-Aktivität nach Beendigung der erzwungenen Fortbewegung zu beurteilen.
   

2. Analyse von 2pFLIM-Bildern

1. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in FLIMview und stellen Sie die folgenden Parameter in FLIMview ein.

1. Klicken Sie auf die Felder für die minimale und maximale Reichweite der Einzelphotonenzählung (SPC) in FLIMview. Geben Sie den entsprechenden minimalen und maximalen SPC-Bereichswert ein, der in der Regel zwischen 1,2 und 10 bis 12 ns liegt.

2. Klicken Sie auf das t₀ Wertfeld in FLIMview und geben Sie das t ein₀ Wert (in der Regel ~2 ns). Klicken Sie in FLIMview auf das Feld für den minimalen Schwellenwert für die Lebensdauer und geben Sie den gewünschten Schwellenwert auf 5−30 Photonen ein.

2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Neue Gruppe" (N) und weisen Sie einen Experimentgruppennamen zu. Dadurch wird eine Gruppe generiert, die die Daten aus jedem hinzugefügten FLIM-Bild kombiniert.

3. Klicken Sie auf die ROI Schaltfläche in der Roi Controls Modul von FLIMview und zeichnen Sie einen ROI um ein tAKARα-positives Soma. Reduzieren Sie den Z-Stapel-Bereich, indem Sie die untere und obere Z-Grenze im z-stack Control Schieberegler in FLIMview, um die Signalkontamination durch Hintergrundphotonen in anderen z-Tiefen zu minimieren.

4. Klicken Sie auf die Schaltfläche +, um das FLIM-Bild zur Gruppe hinzuzufügen (Schritt 2.2). Klicken Sie auf das <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Calc Schaltfläche zur Berechnung der mittleren Lebensdauer (LT, auch mittlere Photonenemissionszeit [MPET] genannt), für den ROI und den Fehler bei der Lebensdauerschätzung (δτ).

5. Öffnen Sie die nächste Datei in der chronologischen 2pFLIM-Imaging-Serie. Wiederholen Sie Schritt 2.4. Achten Sie darauf, die Position des ROI- und Z-Stack-Bereichs anzupassen, um das gleiche tAKARα-positive Soma im Laufe der Zeit zu messen, da es im Laufe der Zeit zu Gewebedrift kommen kann.

6. Wählen Sie die deltaMPET/MPET₀ im Dropdown-Menü des Gruppen-SteuerelementeModul. Klicken Sie auf das Feld baseline# Feld und geben Sie die Indizes ein (z. B. 1 2 3 4 5 für die ersten fünf Bilder in der in Schritt 2.3 erstellten Gruppe). Dadurch werden die Bilder definiert, die zur Berechnung der Baseline-Lebensdauer verwendet werden (LT₀).

7. Klicken Sie auf Plot<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> um ein Diagramm zu generieren, das die FLIM-Antwort (ΔLT/LT₀) von tAKARα während des Experiments in den definierten ROIs. Normalisierte Änderungen der Lebensdauer (ΔLT) einzelner ROIs um die entsprechende Basislebensdauer (LT₀) den Vergleich der PKA-Aktivität während der Fortbewegung über verschiedene ROIs hinweg ermöglichen.

Results

Materials