Dreidimensionale Visualisierung einer Tollwutvirusinfektion im Hirngewebe von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Zaeck, L., et al. Hochauflösende 3D-Bildgebung von Tollwutvirusinfektionen in lösungsmittelfreiem Hirngewebe. J. Vis. exp. (2019).

Dieses Video zeigt den Prozess der Aufbereitung und Bildgebung von mit dem Tollwutvirus (RABV) infiziertem Hirngewebe von Mäusen, um das Fortschreiten der Infektion zu bewerten. Es werden die wichtigsten Schritte beschrieben, einschließlich der Gewebefärbung mit fluoreszierenden Markern, der Dehydratisierung, der Reinigung und der Montage für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, die in der Erzeugung einer dreidimensionalen Darstellung gipfelt.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

RABV-infiziertes, mit Paraformaldehyd (PFA) fixiertes archiviertes Gehirnmaterial verwendet.

VORSICHT: Dieses Protokoll verwendet verschiedene giftige und/oder schädliche Substanzen, einschließlich PFA, Methanol (MeOH), Wasserstoffperoxid (H₂O₂), Natriumazid (NaN₃), tert-Butanol (TBA), Benzylalkohol (BA), Benzylbenzoat (BB) und Diphenylether (DPE). MeOH und TBA sind leicht entzündlich. Vermeiden Sie eine Exposition, indem Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) tragen und Experimente in einem Abzug durchführen. Sammeln Sie den Abfall getrennt in geeigneten Behältern und entsorgen Sie ihn gemäß den örtlichen Vorschriften. Das Tollwutvirus ist als Erreger der Biosicherheitsstufe (BSL)-2 eingestuft und kann daher in der Regel unter BSL-2-Bedingungen gehandhabt werden. Einige Aktivitäten, einschließlich Verfahren, die Aerosole erzeugen können, die mit hohen Viruskonzentrationen arbeiten oder mit neuartigen Lyssaviren arbeiten, können eine BSL-3-Einstufung erfordern. Eine Präexpositionsprophylaxe wird für Personal mit hohem Risiko, einschließlich Tierpfleger und Labormitarbeiter, empfohlen. Beachten Sie die Vorschriften der örtlichen Behörden.

1. Fixierung des Hirngewebes und Schnitt

1. Behandeln Sie Gehirnproben in einem geeigneten Volumen von 4 % PFA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS [pH 7,4]) für mindestens 48 h bei 4 °C (mit einem ungefähren Gewebe-zu-Fixiermittel-Verhältnis von 1:10 [v/v]).
2. Waschen Sie die Gewebeproben 3x in PBS für mindestens 30 min pro Waschgang und lagern Sie sie in 0,02% NaN₃/PBS bei 4 °C bis zur Verwendung.
3. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Vibratom in 1 mm dicke Schnitte (Klingenvorschub: 0,3–0,5 mm/s, Amplitude: 1 mm, Scheibendicke: 1.000 μm).
4. Um die korrekte Schnittsequenz beizubehalten, lagern Sie jeden Gewebeabschnitt separat in einer Vertiefung einer Multiwell-Zellkulturplatte. 0,02 % NaN₃/PBS zugeben und die Gewebeschnitte bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.

2. Probenvorbehandlung mit Methanol

HINWEIS: Alle Inkubationsschritte mit sanfter Oszillation und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchführen. Schützen Sie die Proben vor Licht. Die Probenvorbehandlung dient dem übergeordneten Zweck, die Antikörperdiffusion zu verbessern und die Autofluoreszenz des Gewebes durch Exposition gegenüber MeOH bzw. H zu reduzieren₂O₂.

1. Bereiten Sie 20%ige (v/v), 40 %, 60 % und 80 %ige MeOH-Lösungen in destilliertem Wasser vor. Für 20 % MeOH werden beispielsweise 10 ml 100 % MeOH zu 40 ml destilliertem Wasser in ein geeignetes, verschließbares Gefäß gegeben und durch Umdrehen gemischt.
2. Übertragen Sie die Proben in angemessen große Gefäße (z. B. 5-ml-Reaktionsgefäße). Achten Sie darauf, Materialien zu verwenden, die chemisch beständig gegen die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien sind. Beachten Sie beispielsweise, dass Polypropylen zwar geeignet ist, Polystyrol jedoch nicht.
   HINWEIS: Die Volumenspezifikationen in diesem Protokoll beziehen sich auf 5-ml-Reaktionsgefäße. Wenn ein anderes Gefäß verwendet wird, passen Sie die Volumina entsprechend an.
3. Die Proben werden in 4 ml jeder Konzentration der vorbereiteten Serie von MeOH-Lösungen in aufsteigender Reihenfolge für jeweils 1 h inkubiert.
4. Inkubieren Sie die Proben 2x für je 1 h in reinem (100%) MeOH.
5. Kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab (z. B. in einem laborgeeigneten Kühlschrank).
6. Bereiten Sie die Bleichlösung (5% H₂O₂ in MeOH) vor, indem Sie z.B. eine 30%ige H₂O{TAG_188}}2 Stammlösung im Verhältnis 1:6 verdünnen Reines (100%) MeOH und kühlen Sie es bei 4 °C.
7. Entfernen Sie das 100%ige MeOH aus den gekühlten Proben und fügen Sie 4 mL vorgekühlte Bleichlösung (5 % H_{2{TAG_201}}}{TAG_203}}O₂ in MeOH hinzu. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
8. Die Bleichlösung gegen 4 mL 80% MeOH austauschen und 1 h inkubieren. Die vorbereitete Serie von MeOH-Lösungen in absteigender Reihenfolge für jeweils 1 h verwenden, bis die Proben 1 h lang in 4 mL mit 20 % MeOH inkubiert wurden.
9. Waschen Sie die Proben 1x für 1 h mit 4 mL PBS.

3. Immunfärbung

HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationsschritte mit sanfter Oszillation und, falls nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durch. Schützen Sie die Proben vor Licht. Um mikrobielles Wachstum zu verhindern, geben Sie NaN₃ bis zu einer Endkonzentration von 0,02 % zu den Lösungen in diesem Abschnitt. Die Gewebeproben werden durch Behandlung mit den nichtionischen Detergenzien Triton X-100 und Tween 20 weiter permeabilisiert. Normales Serum wird verwendet, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Glycin und Heparin werden hinzugefügt, um den Hintergrund der Immunmarkierung zu reduzieren.

1. Waschen Sie die Proben 2x für jeweils 1 h in 4 mL mit 0,2 % Triton X-100/PBS.
2. Permeabilisieren Sie die Proben 2 Tage lang bei 37 °C mit 4 ml 0,2 % Triton X-100/20 % Dimethylsulfoxid (DMSO)/0,3 M Glycin/PBS.
3. Blockieren Sie die unspezifische Bindung von Antikörpern, indem Sie die Proben 2 Tage lang bei 37 °C in 4 ml 0,2 % Triton X-100/10 % DMSO/6 % normalem Serum/PBS inkubieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie normales Serum von derselben Spezies, in der der Sekundärantikörper aufgezogen wurde, um ideale Blockierungsergebnisse zu erzielen.
4. Die Proben werden 5 Tage lang bei 37 °C in 2 ml Primärantikörperlösung (3 % Normalserum/5 % DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 mit Heparin] + Primärantikörper/Antikörper) inkubiert. Die Primärantikörperlösung wird nach 2,5 Tagen aufgefrischt.
   1. Für PTwH wird das Heparin-Natriumsalz in destilliertem Wasser zu einer 10 mg/ml-Stammlösung rekonstituiert (diese Lösung aliquotiert bei 4 °C lagern). Die Stammlösung wird mit 0,2 % Tween 20/PBS bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben.
      HINWEIS: Die Wahl der richtigen Antikörperverdünnung kann eine Optimierung erfordern. Im Allgemeinen sind immunhistochemische Standardkonzentrationen ein guter Ausgangspunkt.
5. Waschen Sie die Proben 1 Tag lang in 4 mL PTwH, wechseln Sie den Waschpuffer mindestens 4x–5x am Tag und lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht einwirken.
6. Die Proben werden 5 Tage lang bei 37 °C in 2 ml Sekundärantikörperlösung (3 % Normalserum/PTwH + Sekundärantikörper/Sekundärantikörper) inkubiert. Die Sekundärantikörperlösung wird nach 2,5 Tagen aufgefrischt.
   1. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper/die Sekundärantikörper bei 1:500 in Sekundärantikörperlösung (d. h. 4 μl in 2 ml).
7. Waschen Sie die Proben 1 Tag lang, wie in Schritt 3.5 beschrieben, und lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht.

4. Kernfärbung

HINWEIS:{TAG_342}} Alle Inkubationsschritte mit sanfter Oszillation und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchführen. Schützen Sie die Proben vor Licht. Wenn keine Kernfärbung erforderlich ist oder die Anregungswellenlänge/das Emissionsspektrum von Thiazolrot (TO-PRO-3) für die Anregung oder den Nachweis eines anderen Fluorophors erforderlich ist, überspringen Sie diesen Schritt.

1. Verdünnen Sie die Nukleinsäurefärbung TO-PRO-3 bei 1:1.000 in PTwH und inkubieren Sie die Proben in 4 mL Kernfärbelösung für 5 h.
2. Waschen Sie die Proben 1 Tag lang, wie in Schritt 3.5 beschrieben, und lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht liegen.
   HINWEIS: Nach den Waschgängen können die Proben bis zur optischen Reinigung in PBS bei 4 °C gelagert werden.

5. Gewebereinigung

HINWEIS:{TAG_383}} Führen Sie alle Inkubationsschritte mit sanfter Oszillation und, falls nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durch. Schützen Sie die Proben vor Licht. Die Gewebeproben werden in einer abgestuften Reihe von TBA-Lösungen dehydriert. Da für die Immunfärbung wässrige Lösungen erforderlich sind, müssen alle Färbeverfahren vor der Gewebereinigung abgeschlossen sein. Die optische Clearance und die Brechungsindexanpassung werden durch eine Behandlung mit einer Mischung aus BA, BB und DPE erreicht. Die Clearing-Lösung wird mit DL-α-Tocopherol als Antioxidans ergänzt.

1. Bereiten Sie 30 % (v/v), 50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 96 % TBA-Lösungen in destilliertem Wasser vor. Zum Beispiel für 30 % TBA 15 ml 100 % TBA zu 35 ml destilliertem Wasser in ein geeignetes, verschließbares Gefäß geben und durch Umdrehen mischen.
   HINWEIS: TBA hat einen Schmelzpunkt von 25–26 °C; Daher neigt es dazu, bei Raumtemperatur fest zu sein. Zur Herstellung von TBA-Lösungen erhitzen Sie die gut verschlossene Flasche bei 37 °C in einem Inkubator oder Wasserbad.
2. Die Proben werden mit 4 mL jeder Konzentration der vorbereiteten Serie von TBA-Lösungen in aufsteigender Reihenfolge für jeweils 2 h dehydriert. Lassen Sie die 96 % TBA über Nacht.
3. Dehydrieren Sie die Proben weiter in reiner (100%) TBA für 2 h.
4. {{}}Bereiten Sie die Reinigungslösung BABB-D15 vor.
   HINWEIS: BABB-D15 ist eine Kombination aus BA und BB (BABB), die mit DPE in einem Verhältnis von x:1 gemischt wird, wobei x{ im Namen der Lösung angegeben ist, in diesem Fall 15.
   1. Für BABB einen Teil BA mit zwei Teilen BB mischen.
   2. BABB und DPE im Verhältnis 15:1 mischen.
   3. Fügen Sie 0,4 Vol.-% DL-α-Tocopherol (Vitamin E) hinzu.
      HINWEIS: Mischen Sie beispielsweise für 20 mL BABB-D15 6,25 mL BA mit 12,5 mL BB. Fügen Sie 1,25 ml DPE hinzu und ergänzen Sie es mit 0,08 ml DL-α-Tocopherol.
5. Die Proben in der Reinigungslösung klären, bis sie optisch transparent sind (2–6 h).
6. Die Proben können bis zur Montage und Bildgebung bei 4 °C im BABB-D15 lichtgeschützt gelagert werden.

6. Probenaufnahme

1. Drucken Sie mit einem 3D-Drucker die Bildgebungskammer und den Deckel (Material: Copolyester [CPE], Düse: 0,25 mm, Schichthöhe: 0,06 mm, Wandstärke: 0,88 mm, Wandstärke: 4, Füllung: 100%, keine Stützstruktur).
2. Bauen Sie die Bildgebungskammer zusammen (Abbildung 1).
   1. Montieren Sie ein rundes Deckglas (Durchmesser: 30 mm) mit RTV-1 (Einkomponenten-Raumtemperatur-Vulkanisation) Silikonkautschuk auf die Bildgebungskammer. Entfernen Sie den überschüssigen Silikonkautschuk mit einem wasserbenetzten Wattestäbchen und härten Sie ihn über Nacht aus.
   2. Montieren Sie ein rundes Deckglas (Durchmesser: 22 mm) mit RTV-1 Silikonkautschuk auf den Deckel. Entfernen Sie den überschüssigen Silikonkautschuk mit einem wasserbenetzten Wattestäbchen und härten Sie ihn über Nacht aus.
3. Geben Sie die Probe in eine Bildgebungskammer, fügen Sie ein kleines Volumen BABB-D15 hinzu und setzen Sie den Deckel ein. Füllen Sie die Kammer mit BABB-D15 durch den Einlass mit einer Injektionsnadel (27 G x 3/4 Zoll [0,40 mm x 20 mm]).
4. Verschließen Sie den Einlass und verschließen Sie die Bildgebungskammer mit RTV-1-Silikonkautschuk. Über Nacht im Dunkeln aushärten.

7. Bildgebung und Bildverarbeitung

1. Richten Sie die Bildaufnahme ein, indem Sie die entsprechenden Laserlinien passend zu den verwendeten Fluorophoren auswählen. Passen Sie die Erfassungsbereiche jedes Detektors an, um eine Signalüberlappung zwischen den Kanälen zu vermeiden.
   HINWEIS: Beispielhafte Nachweisbereiche für Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 und TO-PRO-3 sind 500–550 nm, 590–620 nm bzw. 645–700 nm.
2. Wählen Sie die Aufnahmeparameter aus, definieren Sie den oberen und unteren Rand des Z-Stapels und erfassen Sie den Bildstapel.
   HINWEIS: Beispielhafte Erfassungsparameter sind ein sequentieller Scan mit einer Pixelgröße von 60-90 nm, eine Z-Schrittgröße von 0,5 μm, ein Zeilendurchschnitt von 1, eine Scangeschwindigkeit von 400 Hz und eine Lochblendengröße von 1 Airy-Einheit.
3. Verarbeiten Sie den Bildstapel mit einer geeigneten Bildanalysesoftware (z. B. Fidschi), um 3D-Projektionen zu generieren oder eingehende Analysen durchzuführen.
   HINWEIS: Aufgrund der Größe der erfassten Bilddateien ist in der Regel die Verwendung einer Workstation erforderlich.
   1. Öffnen Sie die Aufnahme- oder Bilddatei(en) in Fidschi (Datei |{ {TAG_589}} Öffnen | Dateien auswählen).
      1. Wenn Sie z. B. LIF-Dateien verwenden, aktivieren oder deaktivieren Sie die gewünschten Optionen im Dialogfenster Bioformate. View-Stack mit Hyperstack. Abgesehen davon sind keine spezifischen Auswahlen oder Häkchen erforderlich. Drücken Sie OK.
      2. Wenn die Datei mehrere Bildstapel enthält, wählen Sie die zu analysierenden Bildstapel aus und bestätigen Sie mit OK.
   2. Führen Sie eine Bleichkorrektur durch, indem Sie das zusammengeführte Bild in einzelne Kanäle aufteilen (Bild |{ {TAG_645}} Farbe | Kanal-Tool, dann wählen Sie Mehr | Kanäle teilen). Wählen Sie für jeden Kanal die Option Bleichkorrektur (Bild | Anpassen | Bleichkorrektur) und wählen Sie Einfaches Verhältnis (Hintergrundintensität: 0.0).
      HINWEIS: In einigen Fällen, z. B. wenn das Signal nicht linear abklingt oder das Signal insgesamt zu schwach ist, kann Simple Ratio fehlschlagen. Versuchen Sie es alternativ mit Exponential Fit oder überspringen Sie die Bleichkorrektur.
   3. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal mit den Schiebereglern an (Bild |{ {TAG_724}} Anpassen | Helligkeit | Kontrast).
   4. Kanäle zusammenführen (Bild |{ {TAG_754}} Farbe | Kanäle zusammenführen{TAG_765}}), Komposit erstellen (Bild | Farbe | Kanal-Werkzeug, Wählen Sie dann Mehr | Make Composite) und konvertieren Sie es in das RGB-Format (Image | {TAG_804}}Color | Kanäle Werkzeug, dann wählen Sie Mehr | Konvertieren in RGB).
   5. Ändern Sie bei Bedarf die Größe des Bildstapels, um die Rechenzeit und die Dateigröße zu reduzieren (Bild | Anpassen | Größe, beide Optionen angekreuzt plus bilineare Interpolation).
   6. Generieren einer 3D-Projektion (Bild | Stapel | 3D-Projekt). Wählen Sie Hellster Punkt als Projektionsmethode und stellen Sie den Schichtabstand so ein, dass er der Z-Schritt-Größe des erfassten Bildstapels entspricht. Um eine maximale Qualität zu erzielen, legen Sie das Inkrement des Drehwinkels auf 1{TAG_885}} fest und aktivieren Sie die Interpolation. Ändern Sie die Gesamtdrehung, die Transparenzschwellenwerte und die Deckkraft nach Bedarf.
   7. Passen Sie bei Bedarf den Kontrast und die Helligkeit an, indem Sie die 3D-Projektion wieder in das 8-Bit-Format konvertieren (Bild | Typ | 8-Bit). Verwenden Sie die entsprechenden Schieberegler (Bild | Anpassen | Helligkeit | Kontrast{TAG_933}}) und konvertieren Sie den Bildstapel erneut in das RGB-Format, wie in Schritt 7.3.4 beschrieben.
   8. Speichern Sie die 3D-Projektion als . TIF-Datei (Bilddateiformat) und .AVI Datei (Videodateiformat).

Ergebnisse

Materialien