Verwendung der spektralen Reflektometrie zur Bestimmung myelinisierter Axondurchmesser in einem fixierten Maushirnschnitt

Zusammenfassung

Quelle: Kwon, J., et al., Spektralreflektometrische Mikroskopie an myelinisierten Axonen in situ. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die Verwendung der spektralen Reflektometrie mit einem hyperspektralen konfokalen Mikroskop zur Analyse von Interferenzmustern und zur Bestimmung myelinisierter Axondurchmesser in fixierten Hirngewebeschnitten.

Protokoll

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p style='line-height:1.79999999999999998;margin-bottom:0pt;margin-top:12pt;' dir='ltr'>Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Prüfung überprüft und genehmigt <

p style='background-color:#ffffff;line-height:1.799999999999999998;margin-bottom:11pt;margin-top:11pt;text-align:justify;' dir='ltr'>1. Calibration

1. Schalten Sie das Mikroskop mindestens 1 h vor der Bildgebung ein, um eine thermische Stabilisierung der Laserquelle zu ermöglichen (siehe Materialtabelle). Schalten Sie dann die Software für spektrales Scannen ein (siehe Materialtabelle) und klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" oben in der GUI (grafische Benutzeroberfläche) (Abbildung 1a).
2. Schalten Sie den Software-Shutter für den Weißlichtlaser (WLL) und die Photomultiplier-Röhre (PMT) ein (Abbildung 1a).
3. Wählen Sie den xyΛ-Modus in der Dropdown-Liste im Erfassungsmodus aus, dann wird der Lasereingangsmodus automatisch von Konstanter Prozentsatz auf Konstante Leistung geändert. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatische SP-Bewegung. Stellen Sie dann das Spektralfenster des Eingangslasers auf 470–670 nm und die spektrale Schrittweite auf 4 nm in den Λ-Excitation Lambda Scan-Einstellungen ein (Abbildung 1b).
4. SETZEN Sie den Spektralbereich von PMT auf 450-690 nm, indem Sie auf die Einstellleiste für den Spektralbereich doppelklicken oder diese verschieben (Abbildung 1c).
   Hinweis: Dieser Spektralbereich sollte die gesamte Bandbreite der Eingangsquelle umfassen.
5. Wählen Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit einer hohen numerischen Apertur (NA > 0,7) und geben Sie einen beliebigen Wert für PMT und Laserleistung, um AOBS zu aktivieren (Akusto-optischer Strahlteiler) Konfiguration und Live-Scan-Schaltfläche. Schalten Sie den optischen Pfad um, indem Sie die Reflexion in der AOBS-Konfiguration überprüfen (Figure 1d).
6. Montieren Sie einen Referenzspiegel (siehe Materialtabelle) auf dem Mikroskoptisch. Die Spiegelfläche sollte zur Objektivlinse zeigen. Wenn es nicht einfach ist, den Spiegel auf dem Mikroskoptisch zu montieren, kleben Sie einen Spiegel auf eine flache Platte (z.B., slide Glas).
7. Steuern Sie den Mikroskoptisch, um die Brennebene auf die Spiegeloberfläche auszurichten.
8. Passen Sie die PMT-Verstärkung und die Laserleistung unter Berücksichtigung des Dynamikbereichs des Detektors an und ändern Sie dann den Lasereingangsmodus von Konstanter Prozentsatz auf Konstante Leistung.
   Note: Wie üblich wird bei 570 nm eine PMT-Verstärkung von 500 (V) und eine relative Laserleistung von 0,1 % verwendet.
9. Bestätigen Sie in einem Pseudofarbmodus, um zu überprüfen, ob im gesamten Wellenlängenbereich keine Sättigung vorhanden ist. Wenn eine Sättigung beobachtet wird, verringern Sie die Laserleistung (Abbildung 1a).
10. Führen Sie die Lambda Scan-Erfassung aus.
11. Entfernen Sie den Spiegel von der Bühne und wiederholen Sie die gleiche Aufnahme ohne Probe, um die dunkle Referenz zu erhalten (d.h., dunkler Versatz).
12. Speichern Sie die Daten in einem Multistacked TIF-Format.

2. SpeRe (Spektrale Reflektometrie) Bilderfassung

1. Lege das montierte Gewebe auf den Mikroskoptisch. Um das Gewebe grob auf die Brennebene der Objektivlinse auszurichten, verwenden Sie den Weitfeld-Fluoreszenzmodus durch ein Okular.
2. Mit dem Live Scan eingeschaltet, steuern Sie den Mikroskoptisch, um die Brennebene auf den interessierenden Bereich im Gewebe auszurichten. Um Hintergrundgeräusche durch das Deckglas zu vermeiden, wählen Sie den Zielbereich von mindestens 15 μm Tiefe von der Glas-Gewebe-Grenzfläche aus.
3. Erfassen Sie den spektralen Bildstapel für den Zielbereich mit dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 1.1 bis 1.10 beschrieben.
4. Speichern Sie die Daten für das Gewebe und den dunklen Versatz in einem Multistacked TIF Format.
   Hinweis: Die Der Versuchsleiter kann in diesem Stadium pausieren.

3. Bildverarbeitung und -analyse

1. Öffnen Sie die Spektraldaten (Multi-Stacked TIF) für den Referenzspiegel und das Hirngewebe in ImageJ.
2. Wählen Sie die ROIs (Regions of Interest) für die geöffneten Bildstapel aus – den zentralen Bereich für den Referenzspiegel und das Segment einer Axonfaser für das Hirngewebe.
3. Erfassen Sie die Rohspektren für die ausgewählten ROIs, indem Sie Image → Stacks → Plot Z-axis profile im ImageJ-Menü.
4. Öffnen Sie die Dunkelversatzdaten, von denen eine für den Referenzspiegel und die andere für das Hirngewebe aufgenommen wurde.
5. Erfassen Sie die Spektren für die dunklen Offsets, indem Sie Image → Stacks → Plot Z-axis profile im ImageJ-Menü.
6. Speichern Sie alle erfassten Spektren, indem Sie die Optionen Copy and Paste style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Optionen verwenden.
   Note: Für die SpeRe-Bildgebung wird die Verwendung des zentralen Bildgebungsfeldes empfohlen, um optische Aberrationen außerhalb der Achse zu minimieren. Die Axonfasern können entlang ihrer Länge strukturell heterogen sein. Daher wird empfohlen, den ROI für ein kleines Axonsegment, typischerweise < 5 μm, zu wählen, um Teilvolumenartefakte zu minimieren.

Ergebnisse

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Wasser-Immersionstyp.
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab<
Mirror<	PF10-03-P01	Beschichtet mit geschütztem Silber.
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Dicke: #1 (0,13 bis 0,17 mm).
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Dicke: ~1 mm.
Super glue	Henkel	Loctite 406	Verwenden Sie ein Ausgabegerät, um Haut- oder Augenkontakt zu vermeiden.
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 wurde eingestellt und durch EXU-6 ersetzt.

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