Visualisierung von Motoneuronenprojektionen und Axonverzweigungen mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Abstract

Source: Liau, E. S. et al. Visualisierung der motorischen Axonnavigation und Quantifizierung der Axon-Arborisierung in Mausembryonen mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. J. Vis. (2018).

Dieses Video zeigt die Verwendung von Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie zur Abbildung von Motoneuronenprojektionen und Axonverzweigungen in transgene Mausembryonen. Es beschreibt die Schritte bei der Probenvorbereitung, der Bildgebung und der 3D-Rekonstruktion axonaler Verzweigungen zur Beurteilung des Wachstums und der Konnektivität von Motoneuronen.

Protocol

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Tierschutzbehörde überprüft und genehmigt. Überprüfungsausschuss.

1. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) (2–3 h)

1. Sample set-up<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
2. Richten Sie 5X/0.1 Beleuchtungsoptik und 5X/0.16 Erkennungsoptik ein. Montieren Sie den Probenhalter und die Probenkapillare (1,5 mm Innendurchmesser, grün) und setzen Sie sie in das Mikroskop ein.
   HINWEIS: Detaillierte Einrichtungsverfahren finden Sie in der Bedienungsanleitung des Mikroskops.
3. Montieren Sie den Embryo wie folgt:
   1. Bereiten Sie die Pipettenspitze des P200 vor, indem Sie den oberen Teil so abschneiden, dass er dem Durchmesser der Kapillare entspricht, und entfernen Sie den spitzen Teil (~ 3 mm) für den Probenaufsatz.
   2. Schmelzen Sie das abgestumpfte Ende der Pipettenspitze mit einer kleinen Flamme.
   3. Löschen Sie die Flamme und befestigen Sie den Embryo schnell senkrecht am geschmolzenen Ende.
   4. Setzen Sie den oberen Teil der Pipettenspitze in die Probenkapillare ein.
4. Lassen Sie den Kammerpuffer 1 Minute lang mit dem Embryo äquilibrieren, um Ablagerungen oder Blasen zu entfernen.
5. Wählen Sie mit der Imaging-Software Locate capillary unter dem Locate tab und passen Sie die X-, Y- und Z-Achsen an, um die Probenkapillare zu positionieren.
6. Wählen Sie Locate sample und zoomen Sie auf das 0,6-fache, um auf den Embryo zu fokussieren. Drehen Sie den Embryo, um sicherzustellen, dass die Längsachse des abgebildeten Gliedes mit dem Strahlengang der beiden Lichtquellen ausgerichtet ist (Figure 1B).

Image acquisition

1. Unter dem Erfassung Tab, definiere die Lichtwegparameter wie Erkennungsobjektive, Laserblockfilter, Strahlteiler, Kameras und Laser.
   HINWEIS: In diesem Experiment wird der Kanal des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) verwendet (Anregungswellenlänge: 488 nm; Emissionsfilter: Bandpass (BP) 505 bis 545 nm; Strahlteiler: SPS LP 560).
2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den Pivot-Scan für die Schattenreduzierung.
3. Definieren Sie die Erfassungseinstellungen: Bittiefe, 16 Bit; Zoom, 0,36-0,7X; einseitige Beleuchtung (links/rechts) oder beidseitige Beleuchtung.
4. Klicken Sie auf Continuous und stellen Sie die Laserintensität, die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Position des Lichtblatts ein, um schärfere Bilder zu erhalten.
   HINWEIS: Die Laserleistung wird so gering wie möglich gehalten, um Lichtschäden zu minimieren.
5. Drücken Sie STOP , um die Bildaufnahme zu beenden.

Mehrdimensionale Erfassung

1. Definieren Sie den Z-Stapel, indem Sie die Z-Position für das erste und letzte Bild verschieben. Klicken Sie auf Optimal um die Slice-Nummer festzulegen.
2. Klicken Sie auf Start Experiment, um den ausgewählten Z-Stapel zu erhalten.
3. Wenn es fertig ist, speichern Sie das Bild im .czi-Format.

Bildverarbeitung (optional)

1. Fahren Sie fort mit Dual Side Fusion unter dem Lightsheet-Verarbeitung Kanal, wenn beidseitige Beleuchtung angewendet wird. Multiview-Verarbeitung ist notwendig, wenn Mehrfachansichten erfasst werden, um Bilder aus mehreren Blickwinkeln zu kombinieren.
2. Erstellen Sie ein 2D-Bild mit Daten aus den Pixeln mit der höchsten Intensität entlang der Projektionsachse unter dem Maximum Intensity Projection Kanal.
3. Unter dem Copy Kanal, klicken Sie auf Subset<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>, um Teilmengen von Bildern aus dem ursprünglichen Satz auszuwählen.

2. Quantifizierung der Axon-Arborisierung (30 min für jeden einzelnen Nerv)

1. Öffnen Sie die Bilddatei in der Bildanalysesoftware (standardmäßig wird das Bild mit den XYZ-Daten im Surpass-Modus und als 3D-gerenderte Ansicht geöffnet).
2. Passen Sie die Farbe, Helligkeit und den Kontrast des Bildes mit dem <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Display Adjustmentwindow (Bearbeiten | Show Display Adjustment), um Filamente basierend auf dem lokalen Intensitätskontrast zu erkennen.
3. Klicken Sie auf das Add New Filaments Symbol und wählen Sie das Symbol Autopath (no loop) Algorithmus im Dropdown-Menü.
4. Wählen Sie den interessierenden Bereich aus (in diesem Fall das Segmentierungsaxon von Interesse). Klicken Sie auf Next wenn fertig.
5. Definieren Sie die Start- und Ausgangspunkte, indem Sie die größten und dünnsten Durchmessermaße zuweisen, die mit dem <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Slice Modus.
6. Weisen Sie einen Startpunkt am Rand des interessierenden Bereichs zu. Um das manuelle Hinzufügen oder Entfernen von Startpunkten zu erreichen, ändern Sie zuerst den Zeigermodus (Navigate | Select) und dann Umschalt + Rechtsklick an den Points of Interest.
7. Wählen Sie manuelle Schwellenwerte für Kernpunkte, um sicherzustellen, dass die gesamte sichtbare Baumbildung markiert ist. Ändern Sie den Zeigermodus (Navigieren | Select) und dann Umschalt + Linksklick an den Points of Interest, um Seed-Punkte manuell hinzuzufügen oder zu entfernen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, Hintergrundgeräusche und Signale von benachbarten Nerven manuell zu entfernen.
8. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Entfernen Sie Seed-Punkte um Startpunkte.
9. Überprüfen Sie Entfernen Sie getrennte Segmente den Ausschluss von Punkten zu ermöglichen, die zu weit entfernt sind und Hintergrundgeräusche darstellen können. Geben Sie die Maximale Lückenlänge im nächsten Schritt, um die Obergrenze für zu definieren. Ausschluss.
10. Passen Sie den Schwellenwert für die Hintergrundsubtraktion an, bei der ein Gaußscher Filter verwendet wird, um die Hintergrundintensität jedes Voxels zu schätzen.
11. Legen Sie den automatischen Schwellenwert für den Dendritendurchmesser mit dem <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Ungefähre Querschnittsfläche Algorithmus.
12. Überspringen Sie die Schritte zur Berechnung der Wirbelsäule.
13. Beenden Sie den Vorgang und wählen Sie den gewünschten Stil und die gewünschte Farbe.
14. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Volumen in Properties um nur die rekonstruierten Axone anzuzeigen.
15. Unter dem Statistics Tab, wählen Sie Detailed<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. Use Filament Nr. Dendrite Terminal Points, um die motorischen Nervenendigungen als Indikator für die motorische Axonverbarrung zu quantifizieren.
    HINWEIS: Statistisch Bei Bedarf können Anmerkungen hinzugefügt werden.
16. Exportieren Sie das Bild des rekonstruierten Axons als .tif Datei.

Results

Materials