Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Zusammenfassung

Eine Ethylenglykol-Basis Verglasung Methode zur Maus-Embryonen beschrieben. Es ist vorteilhaft, andere Methoden in ihrer Einfachheit und niedrigen embryonalen Toxizität, und kann daher weitgehend auf viele Stämme von Mäusen, einschließlich Inzucht-und Gen-veränderten Mäusen.

Zusammenfassung

Kryokonservierung von Maus-Embryonen ist eine technologische Basis, die biomedizinischen Wissenschaften unterstützt, da viele Stämme von Mäusen durch genetische Modifikationen hergestellt worden sind und die Zahl ist konstant steigt von Jahr zu Jahr. Seine technische Entwicklung begann mit langsamen Einfrieren Methoden in den 1970er Jahren ^1, dann durch Verglasung Methoden in den späten 1980er Jahren ² entwickelt gefolgt. Im Allgemeinen ist die letztere Technik den Vorteil, ihre Schnelligkeit, Einfachheit und hohe Überlebensfähigkeit der Embryonen gewonnen. Allerdings sind die Frostschutzmitteln enthaltene hochgiftige und können nachfolgende Entwicklung des Embryos beeinflussen. Daher wurde die Technik nicht für bestimmte Stämme von Mäusen, auch wenn die Lösungen bis 4 ° C abgekühlt, um die toxische Wirkung beim Embryo Handling zu mildern. Am RIKEN BioResource Center, sind mehr als 5000 Mausstämme mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und Phänotypen ³ gehalten, und deshalb haben wir eine Verglasung te optimiertchnique, mit denen wir Embryonen aus vielen verschiedenen Stämmen von Mäusen Kryokonservierung, mit den Vorteilen der hohen Embryo Überleben nach Verglasung und Auftauen (oder Verflüssigung, genauer gesagt) bei Umgebungstemperatur Temperatur ^4.

Hier präsentieren wir eine Verglasung Methode zur Maus-Embryonen, die erfolgreich an unserem Zentrum eingesetzt. Die Kryokonservierung Lösung enthält Ethylenglykol anstelle von DMSO, um die Toxizität von Embryonen ⁵ zu minimieren. Es enthält auch Ficoll und Saccharose für die Prävention von Entglasung und osmotische Anpassung, bzw.. Embryonen können bei Raumtemperatur behandelt und übertragen in flüssigen Stickstoff innerhalb von 5 min. Da die ursprüngliche Methode für Kunststoff-Strohhalme als Container optimiert wurde, haben wir etwas das Protokoll für Kryoröhrchen, die leichter zugänglich in den Laboratorien und widerstandsfähiger gegen körperliche Schäden sind modifiziert. Wir beschreiben auch die Verfahren nach dem Auftauen verglaste Embryonen im Detail, weil es eine kritische ste istp für eine effiziente Rückgewinnung von lebenden Mäusen. Diese Methoden wäre es hilfreich, Forscher und Techniker, die Erhaltung der Mausstämme für den späteren Gebrauch müssen in einem sicheren und kostengünstige Weise.

Protokoll

Die allgemeine Systematik des Experiments ist in Abb. dargestellt. 1.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Machen Sie den Basis-Medium (hier als PB1 bekannt) in einem 100 ml-Glasflasche nach der folgenden Tabelle unten:

   	MW	mM	mg/100ml
   NaCl	58,4	136,98	800,0
   KCl	74,6	2,68	20,0
   KH 2 PO 4	136,1	1,47	20,0
   Na 2 HPO 4 · 12 H 2 O	358,14	8,04	288,1
   MgCl 2, 6H 2 O	203,3	0,49	10,0
   	180,2	5,56	100,0
   Na-Pyruvat	110	0,33	3,6
   CaCl 2 · 2H 2 O	147	0,9	13,2
   Penicillin G			6,0 (ca.)

2. Machen Sie das Ficoll-Saccharose (FS)-Lösung:
   1. Fügen Sie den folgenden Chemikalien zu 14 ml PB1 Lösung in einer 50 ml Tube.

      Ficoll 70	6,0 g
      Sucrose	3,424 g
      BSA	42.0 mg

   2. Mix Ficoll 70 und Saccharose in PB1-Lösung und gut schütteln, bis sie vollständig gelöst ist.
   3. Nach Prüfung der vollständigen Auflösung vor, fügen BSA auf der Oberfläche der Lösung und hält sie4 ° C bis BSA vollständig gelöst ist (> 4 Stunden oder über Nacht).
3. Machen Sie den Gleichgewichts-Lösung (EFS20) und die Verglasung Lösung (EFS40) in einem 50 ml-Tube:
   • EFS20: 20% (v / v) Ethylenglykol, 24% (w / v) Ficoll und 0,4 mol / L Saccharose in PB1 mit BSA
   • EFS40: 40% (v / v) Ethylenglykol, 18% (w / v) Ficoll und 0,3 mol / L ^* Saccharose in PB1 mit BSA
     ^* Bei Embryonen aus der BALB / c oder ICR-Stamm, erhöhen die Konzentration von Saccharose zu 0,9 mol / L Saccharose, weil sie empfindlicher auf ⁶ cryodamage sind.

   	EFS20 Lösung	EFS40 Lösung
   Ethylenglykol	1 ml	2 ml
   FS-Lösung	4 ml	3 ml

4. Sterilisation der Lösung durch Filtration mit einem 0,45 um filter. Machen Aliquots in 5 ml Polystyrol-Röhrchen und lagern bei 4 ° C. Sie können für ca. 6 Monate verwendet werden.
5. Vorbereitung der Embryo Auftauen Lösung mit 0,75 M Saccharose (TS1)
   1. Lösen Sie 7,7 g Saccharose in PB1 (hergestellt in Schritt 1,1) und bringen das Gesamtvolumen auf 30 ml. Mix durch leichtes Schütteln, bis Saccharose vollständig gelöst ist.
   2. Add 90 mg BSA auf die Oberfläche der Lösung und lassen Sie es stehen bis zur vollständigen Auflösung.
   3. Sterilisation der Lösung durch Filtration.
   4. Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden.
   
   Hinweis: TS1 kann auch aus kommerziell erhältlichen M2 vorbereitet werden.
   
   6. Lösen Sie 7,7 g Saccharose in M2 und bringen das Gesamtvolumen auf 30 ml.
   7. Mix durch leichtes Schütteln, bis Saccharose vollständig gelöst ist.
   8. Sterilisation der Lösung durch Filtration.
   9. Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden.
6. TS2 (Auftauen Lösungmit 0,25 M Saccharose):
   1. 10 ml TS1 mit 20 ml Volumen von PB1 oder M2, als angemessen.
   2. Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. Sie können für etwa 1 Monat verwendet werden.

2. Verglasung von 2-Zellen muriner Embryonen

1. Bereiten Sie 2-Zellen-Maus-Embryonen durch natürliche Paarung oder konventionelle In-vitro-Fertilisation.
2. Aliquot 50 pl EFS40 in ein Kryoröhrchen. Jenseits, führen den Rest der Verglasung Verfahren bei der Raumtemperatur.
3. Aliquot 50 ul EFS20 auf dem Boden einer 35 mm oder 60 mm Kunststoff-Petrischale.
4. Übertragen Sie bis zu 30 Embryonen EFS20 mit einer Glaskapillare mit nur den Mindestbetrag des Kulturmediums. Starten Sie einen Timer für 2 min.
   Hinweis: Legen Embryonen auf der Unterseite des Tropfens. Dies macht eine effiziente Entwässerung von Embryonen. Überprüfen Sie die Morphologie der Embryonen, die durch ein Stereomikroskop. Dehydrated Embryonen zeigen eine geschrumpfte Morphologie, wie in Abb. gezeigt. 2A.Wenn sie nicht dehydriert genug sind, für mehr 1 oder 2 min warten.
5. Bei ca. 1,5 min, nehmen Sie den Embryonen aus dem EFS20 Tropfen nur mit der minimalen Menge der Lösung. Übertragen Sie sie auf EFS40 in der Kryoröhrchen in Schritt 2.1 vorbereitet. Hinweis: Für die besten Ergebnisse erzielen Sie, den Zeitpunkt der Abholung Embryonen, so dass alle Embryonen können in EFS40 bei rund 2 min übertragen werden.
6. Warten Sie 1 min.
7. Legen Sie die Kryoröhrchen direkt in flüssigen Stickstoff (LN _2).

3. Auftauen Vitrified 2-Zellen muriner Embryonen

1. Vor dem Auftauen ein Gericht zubereiten, mit 10 ul Tropfen Embryo Nährboden für aufgefundenen Embryonen (siehe Schritt 3,13). Decken Sie die Schüssel mit Öl und in eine CO _2-Inkubator bis zur Verwendung. Hinweis: Obwohl alle Medien für die Routine Embryokultur in diesem Experiment verwendet werden können, empfehlen wir Medien mit höherer Osmolarität wie M16 Medium.
2. Warm TS1 bis 37 ° C.
3. Setzen Sie auf eine Gesichtsmaske und Kryo. Öffnen Sie die LN ₂ tank und Abrufen einer Kryoröhrchen mit Embryonen.
4. Schnelles Öffnen der Spitze der Tube und entsorgen LN _2. Warten Sie 30 Sek. TS1 vor dem Einfrieren zu verhindern um den nächsten Schritt.
5. Verwenden Sie ein 1000ul Pipette auf 850 ul von TS1 (37 ° C) in die Röhre hinzu und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren (etwa zehnmal in 25 Sekunden), bis die Lösung gleichmäßig gelöst ist.
6. Übertragen Sie die gesamte Volumen der Röhre zu einem Kunststoff 60 mm Petrischale (oder einem Uhrglas) (Abb. 3A). Hinweis: Die Embryonen sollte bei Raumtemperatur (22-25 ° C) behandelt werden, bis sie in einem CO _2-Inkubator bei Step 3,14 platziert werden.
7. Starten Sie einen Timer für 3 min.
8. Mit rund 2 min in TS1, schütteln die Schale, bis das Medium mit Embryonen über die Oberfläche der Schale (Abb. 3B) verteilt ist. Hinweis: Dies wird dazu beitragen die Embryonen nach unten gehen, weil sie nahe an der Oberfläche schwimmen, wenn sie TS1 übertragen.
9. Legen Sie drei 50 ul Tropfen TS2 auf the-Spiegel (Abb. 3C).
10. Nach 3 min in TS1, überprüfen Sie die Morphologie der Embryonen, die durch ein Stereomikroskop, sie sollten leicht geschrumpft sein. Siehe die Morphologie der Embryonen in den früheren (Abb. 2B) und später (Abb. 2C) in TS1. Hinweis: Wenn die Embryonen noch geschwollen, halten sie in TS1 mehr 1 bis 3 min.
11. Nehmen Sie den Embryonen und übertragen Sie sie auf den ersten Tropfen TS2 (Abb. 3D). Starten Sie einen Timer für 3 min
12. Nach 3 min-Embryonen in die zweite und dann die dritte Tropfen (Abb. 3E).
13. Übertragen Sie die Embryonen in das Kulturmedium in Schritt 3.1 vorbereitet. Die Embryonen werden in die Form der Abb.. 2D.
14. Legen Gericht in einem CO _2-Inkubator. Etwa 10 min später-Embryonen in die nächste Tropfen Kulturmedium zu waschen Saccharose, übernommen wurde von TS2 durchgeführt.
15. Weiter Kultur in einem CO2-Inkubator bis Embryotransfer.
    Hinweis: Transfer Embryos zu den Eileitern des Empfängers Weibchen am Tag nach dem Auftauen. Lange Kultur in vitro zu einem Rückgang der Lebensfähigkeit der Embryonen in einigen Stämmen von Mäusen.

4. Repräsentative Ergebnisse:

In vitro - und In-vivo-Entwicklung von Embryonen nach dem Auftauen ist in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Die Vorteile dieses Protokolls sind die hohe Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen und der breiten Anwendbarkeit auf verschiedene Stämme von Mäusen.

Belastung	Gesamtzahl der Röhren	Anzahl der Embryonen verglaste	Recovered (Nr. (%))	Morphologisch normalen (Nr. (%))	Entwicklung zu Blastozysten (Nr. (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / cA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

Tabelle 1. In vitro-Entwicklung von keramisch aufgetauten Embryonen in gemeinsamen Mausstämme

Zustand von Embryonen	Anzahl der Empfänger Weibchen	Anzahl der transferierten Embryonen	Nidationsstellen (Nr. (%))	Live-Nachkommen (Nr. (%))
Frisch	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Verglaste	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

Tabelle 2. In vivo-Entwicklung von keramisch aufgetauten Embryonen in C57BL/6J-Mäuse.

Abbildung 1. Die allgemeine Systematik des Versuchs einschließlich der Äquilibrierung Verglasung und Auftauen von Embryonen.

Abbildung 2. Die Morphologie der Embryonen bei jedem Schritt nach dem Auftauen.

Abbildung 3. Auftauen von Embryonen. Alle Vorgänge werden bei Raumtemperatur durchgeführt. (A), hinzufügen 850 ul von TS1 (37 ° C) in eine Kryoröhrchen und Transfer das gesamte Volumen der Lösung in die Kryoröhrchen auf einer Plastikschale. Zu diesem Zeitpunkt sehen die Embryonen geschwollen wie in Abb. gezeigt. 2B. (B), Spread der Lösung über die Oberfläche der Schale durch leichtes Schütteln. (C), Place drei 50 ul Tropfen TS2 auf der Plastikschale. (D), Transfer der Embryonen in den ersten Tropfen TS2. Nach 3 min, sehen die Embryonen shurunken wie in Abb. gezeigt. 2C. (E), Transfer ihnen seriellely in den verbleibenden TS2 Tropfen und dann in das Kulturmedium.

Diskussion

Seit dem ersten Bericht des Maus-Embryo Verglasung von Rall und Fahy in 1985 ² wurden mehrere technische Verbesserungen vorgenommen, um die Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen zu erhöhen. Einer der erfolgreichsten Modifikationen wurde durch Verwendung von Ethylenglykol als Frostschutzmittel wegen ihrer geringen Toxizität und hohe Membran-Permeabilität erreicht. Solche Vorteile ermöglichen es uns, das Einfrieren von Embryonen bei Raumtemperatur ⁴ Griff, andere Verglasung Methoden erfordern Embryo Übergabe bei kühleren Temperaturen und sind nicht immer für einige Stämme von Mäusen mit BALB / c ^6. Die erste Ethylenglykol-Basis Verglasung wurde von Kasai et al. im Jahr 1990 ^5,7. Da die ursprüngliche Methode für Kunststoff-Strohhalme als Container optimiert wurde, haben wir etwas das Protokoll für Kryoröhrchen, die leichter zugänglich in den Laboratorien und widerstandsfähiger gegen körperliche Schäden sind modifiziert. Daher kann die Verglasung hier beschriebene Methode applicable zu vielen Labors mit Mäusen als wissenschaftlicher Modelle. Die gleiche Methode kann auch für Maus-Embryonen im Morula und Blastozyste Stufen ⁸ und Rattenembryonen ⁹ verwendet werden. Allerdings haben wir vor kurzem festgestellt, dass die Qualität der Kryoröhrchen kann die Überlebensrate von Embryonen nach dem Einfrieren und Auftauen zu beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Innenseite der Kryoröhrchen für seine Glätte vor Verglasen Embryonen (z. B., siehe Tabelle auf der spezifischen Reagenzien und Geräte) zu untersuchen.

Vitrification Methoden haben viele Vorteile gegenüber herkömmlichen langsamen Einfrieren Methoden, aber sie inhärent haben einen Nachteil in Bezug auf Transport-Zweck. Als verglaste Embryonen bei unter -120 gehalten werden sollten ° C, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, sind trocken Verlader in der Regel für ihre sicheren Transport verwendet. Dry Verlader sind schwer und sperrig, und ihre Hin-und Rückfahrt ist teuer, vor allem für internationale Transporte. Wir sind jetzt entwickelt derzeit eine neue Verglasung Methodedie verglaste Embryonen können auf Trockeneis gelagert werden (ca. -80 ° C) für mindestens 7 Tage ^10. Diese Methode sollte die Verglasung der nächsten Generation werden.

Materialien

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Rinderserumalbumin	Merck Biosciences (Calbiochem)	12657
Ethylenglykol	Wako Pure Chemical Industries	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glucose	Wako Pure Chemical Industries	041-00595
NaCl	Wako Pure Chemical Industries	191-01665
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
KH 2 PO 4	Wako Pure Chemical Industries	169-04245
Na 2 HPO 4 · 12H 2 O	Wako Pure Chemical Industries	500-04195
MgCl 2 · 6 H 2 O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
CaCl 2 · 2H2O	Wako Pure Chemical Industries	031-00435
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P-4687
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P-8574
Sucrose	Wako Pure Chemical Industries	196-00015
M16-Medium	Sigma-Aldrich	M7292
M2-Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cryotube	Sumitomo Bakelite	MS-4501	"Kryo-Vial"