Histochemische Bildgebung von kortikalen Modulen in abgeflachten Hirnschnitten

Zusammenfassung

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Source: Lauer, S. M., et al. Visualisierung von kortikalen Modulen in abgeflachten Säugetierrinden. <span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>(2018)<br />

Dieses Video zeigt eine Methode zur Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Gehirnschnitten mittels histochemischer Färbung. Vorfixierte Schnitte werden mit einem Siebreagenz behandelt, das aktive neuronale Cluster hervorhebt und dunkle, kontrastreiche Regionen bildet. Nach dem Einbetten und Dehydrieren erscheinen kortikale Module unter dem Hellfeldmikroskop als dunkle, fleckige Muster.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen ethischen Überprüfungskommission für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Visualisierung von kortikalen Modulen mit Cytochromoxidase-Färbung

HINWEIS: Für den histochemischen Nachweis der Cytochromoxidase-Aktivität wurden verschiedene Färbeprotokolle entwickelt. Dieses Protokoll verwendet Nickel-Ammoniumsulfat (NiAS), was zu einem höheren Kontrast und besser definierten Modulen in gefärbten kortikalen Bereichen führt.

1. Bereiten Sie die Cytochromoxidase-Färbelösung vor. Für 10 ml Lösung fügen Sie 10 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)-Puffer (0,1 M, pH 7,4), 400 mg Saccharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg Cytochrom C und 6 mg Diaminobenzidin (DAB) hinzu.
   VORSICHT: DAB und NiAS sind krebserregend.
   HINWEIS: Fügen Sie DAB kurz vor der Inkubation von Abschnitten hinzu.
2. Waschen Sie die Abschnitte in HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4) auf einem Schüttler für 15 Minuten.
3. Inkubieren Sie die Schnitte in der Färbelösung bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
   HINWEIS: Beobachte die Geschwindigkeit der Färbung. Wenn keine sichtbare Reaktion auftritt, wechseln Sie zur Inkubation bei 37 °C. Je nach Grad der Fixierung kann eine Färbung nach 10 Minuten oder nach mehreren Stunden beobachtet werden.
4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 4 % Paraformaldehyd (PFA); Dies verhindert unerwünschtes Nachfärben und eine Erhöhung des Hintergrundsignals.
5. Waschen Sie die Abschnitte dreimal 10 Minuten lang mit dem HEPES-Puffer
.
6. Montieren und trocknen Sie die Abschnitte auf Objektträgern.
7. Hydratisieren Sie die Abschnitte mit einer zunehmenden Alkoholzeile:
   1. Waschen Sie die Folien 1 Min. in 60% Ethanol. Waschen Sie die Dias 1 Min. in 80% Ethanol. Waschen Sie die Dias 2 Min. in 96% Ethanol. Waschen Sie die Dias 3 Min. in 100% Ethanol. Waschen Sie die Dias 5 Min. in Isopropanol. Waschen Sie die Dias 5 Min. in Xylol.
8. Fügen Sie sofort ein Schnellmontagemedium hinzu und fügen Sie ein Deckglas hinzu. Critical: Verwenden Sie keine Eindeckmittel auf Wasserbasis, da NiAS ausgewaschen wird und die Flecken zersetzt.
9. Bewahren Sie die Abschnitte für die Langzeitlagerung bei 4 °C auf.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cytochromoxidase-Färbung
Cytochrom c aus Pferdeherz	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidintetrahydrochloridhydrat	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Eindeck- oder Gefriermedien
Eukitt (Histochemie)	Sigma-Aldrich	3989
Alkohol-Dehydratisierung
Ethanol 100%	Carl Roth	9065.3
Ethanol 96%	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Xylol-Ersatz	Fluka	78475
Geräte/Werkzeuge
Dumont 55 Pinzette - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont 5 Pinzette - Inox Biology Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont 5SF Pinzette - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00