Dieses Video zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in Ischiasnerven der Maus und Spinalganglien (DRGs). Der Prozess umfasst die Markierung von Immunzellen mit Fluorophor- und Biotin-markierten Antikörpern, die Stabilisierung und Permeabilisierung der Zellen und die Verwendung von Fluoreszenzmarkern zum Nachweis von Zelloberflächen- und Kerneigenschaften. Die Technik ermöglicht eine quantitative Beurteilung der Heterogenität von Immunzellen in Nervengeweben.
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Methodenartikel
Analyse von Immunzellen im Nervengewebe der Maus mittels Durchflusszytometrie
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
1. Verdauung des Ischiasnervs und DRG
- Bereiten Sie das Aufschlussmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure [HEPES], 5 mg/ml Rinderserumalbumin [BSA], 1,6 mg/ml Kollagenase Typ 4) mit 100 μg/ml Desoxyribonuklease vor und lagern Sie es auf Eis.
HINWEIS: Die pro Maus benötigte Menge an Verdauungsmedium (Ischiasnerven + DRGs) beträgt 1 ml. Nach der Zubereitung können die Aliquots des Aufschlussmediums bei -20 °C gelagert werden. - Übertragen Sie die Ischiasnerven und DRGs von einer Maus in separate 1,5-ml-Röhrchen mit 500 μl Verdauungsmedium. Für die Ischiasnerven das Material mit einer Federschere in 15-20 Stücke zerkleinern und anschließend die Gewebesuspensionen in einem Schüttelinkubator bei 37 °C für 20 min unter sanftem Rühren (≤ 450 U/min) inkubieren.
- Zermalen Sie die Zellsuspension wiederholt durch die 1.000-μl-Pipettenspitze, um unvollständig verdautes Gewebe mechanisch zu dissoziieren.
HINWEIS: Wenn die Suspension schwer zu titrieren ist, schneiden Sie die Pipettenspitze mit einer Schere ab, um ein stumpfes Ende zu erhalten. Die Gewebesuspension bei 37 °C für 20 min unter leichtem Rühren (≤ 450 U/min) inkubieren. - Wiederholen Sie die Verreibung durch eine 1.000-μl-Pipettenspitze und inkubieren Sie weitere 10 Minuten bei 37 °C unter leichtem Rühren (≤ 450 U/min).
- Bereiten Sie den FACS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS], ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum [FCS] und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) vor und lagern Sie ihn auf Eis. Spülen und tränken Sie ein Edelstahlsieb mit einer Maschenweite von 140 μm mit Puffer für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) in einer 60 x 15 mm großen Petrischale auf Eis.
HINWEIS: Nylon-Siebfilter sollten vermieden werden, da dies zu einem erheblichen Verlust der Ausbeute an kernhaltigen Zellen führt. - Führen Sie die Gewebesuspensionen wiederholt durch den 140 μm großen Siebfilter, während dieser mit einer stumpfen Pinzette über die Petrischale auf Eis gehalten wird. Sammeln Sie die Zellsuspension aus der Petrischale und geben Sie sie in ein neues 1,5-ml-Röhrchen, das auf Eis gelagert wird.
- Schieben Sie unvollständig verdautes Gewebe, das auf dem Filter verbleibt, durch wiederholtes Verreiben mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze durch. Spülen Sie den Siebfilter zweimal mit 500 μl FACS-Puffer und sammeln Sie die resultierende Zellsuspension in der Petrischale, um sie mit der Zellsuspension aus Schritt 1.6 zu kombinieren.
HINWEIS: Ist das verwendete Durchflusszytometer empfindlich gegenüber Ablagerungen, kann die Zellsuspension aus Schritt 1.7 durch einen 70 μm Siebfilter geleitet werden; Dies kann jedoch zu einem Verlust der Ausbeute an kernhaltigen Zellen führen. - Die Zellsuspensionen werden 5 Minuten lang bei 4 °C bei 300 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 150-350 μl FACS-Puffer, abhängig von der Anzahl der erforderlichen Färbungen (150 μl FACS-Puffer pro Färbeplatte).
2. Färbung des Ischiasnervs und DRG mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern für die Durchflusszytometrie
- Übertragen Sie 100 μl des Ischiasnervs oder der DRG-Zellsuspension in eine V-förmige Vertiefung in einer 96-Well-Platte auf Eis.
HINWEIS: Einfachgefärbte Zellen sind für alle verwendeten Antikörper erforderlich, da sie die notwendigen Kontrollen für die Einrichtung der Durchflusszytometrie in Bezug auf die Spannungsverstärkung und -kompensation der Photomultiplierröhre (PMT) bieten und zur Unterscheidung zwischen spezifischer und unspezifischer Bindung beitragen. - Poolen Sie die verbleibenden Zellsuspensionen (ca. 50 μl pro Probe) entweder aus den Ischiasnerven oder den DRG-Proben, um als ungefärbte Kontrolle zu dienen.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die Platte über einen Behälter drehen und mit einer scharfen Bewegung des Handgelenks vorsichtig trocken klopfen.
- Für die Oberflächenfärbung resuspendieren Sie jedes der Zellpellets in 20 μl FACS-Puffer, der die interessierenden Antikörper (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 und Haupthistokompatibilitätskomplex [MHC] Klasse II-Biotin) enthält, und inkubieren Sie lichtgeschützt 30 Minuten lang auf Eis.
HINWEIS: (1) Die optimale Antikörperverdünnung sollte vor der Verwendung durch Durchführung einer Verdünnungsreihe gemäß der Produktinformation des Herstellers bestimmt werden; (2) Unspezifische Färbungen können durch Inkubation mit Fc-Block in diesem Schritt gemäß den Anweisungen des Herstellers reduziert werden. und (3) Eine Isotyp-Kontrollfärbung ist im Allgemeinen nicht erforderlich, wenn Primärantikörper verwendet werden, die direkt mit einem Fluorophor konjugiert sind, und/oder wenn das/die interessierende(n) Antigen(e) unterschiedliche Populationen erzeugen. - Geben Sie 130 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung und zentrifugieren Sie die Platte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3) und waschen Sie die Zellpellets zweimal mit 150 μl FACS-Puffer.
HINWEIS: Wenn ein unkonjugierter Primärantikörper oder ein an Biotin konjugierter Primärantikörper verwendet wird, kann an dieser Stelle ein geeignetes Sekundärreagenz hinzugefügt werden, das an ein Fluorophor konjugiert ist, und die Schritte 2.4 bis 2.5 werden wiederholt. Im Falle dieses Protokolls wurde Streptavidin-PE/Cy7 oder Streptavidin-PerCP zum Nachweis von MHC Klasse II in Kombination mit CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 bzw. in Kombination mit CD68-APC bzw. F4/80-PE/Cy7 verwendet. - Zur Fixierung resuspendieren Sie die Zellpellets nach dem letzten Waschschritt in 100 μl 4 % Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4). Die Platte wird 10 min lang auf Eis inkubiert und anschließend bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3) entsorgt und die Zellpellets einmal mit 150 μl FACS-Puffer gewaschen.
Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig; tragen Sie angemessenen Schutz wie Handschuhe und Brille, usw.
HINWEIS: Die Zellpellets in 150 μl FACS-Puffer resuspendieren und bis zu zwei Tage lichtgeschützt bei 4° C lagern. Wenn keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 2.11 fort, nachdem Sie die Platte 5 Minuten lang bei 4 °C bei 400 x g zentrifugiert haben. - Für die intrazelluläre Färbung resuspendieren Sie die Zellpellets in 150 μl FACS-Puffer + 0,5 % Reinigungsmittel und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Die Platte wird bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3) verworfen und das Küvettenpellet einmal mit 150 μl FACS-Puffer + 0,5 % Reinigungsmittel gewaschen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 μl FACS-Puffer + 0,5 % Detergens, das die interessierenden Antikörper (CD68-APC, CD206-PE) enthält, und inkubieren Sie es vor Licht geschützt für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- 130 μl FACS-Puffer + 0,5 % Reinigungsmittel in jede Vertiefung geben und die Platte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3) entsorgen und die Zellpellets zweimal mit 150 μl FACS-Puffer + 0,5 % Reinigungsmittel waschen.
HINWEIS: Wenn ein unkonjugierter Primärantikörper oder ein an Biotin konjugierter Primärantikörper verwendet wird, kann an dieser Stelle ein geeignetes Sekundärreagenz, das an ein Fluorophor konjugiert ist, hinzugefügt und die Schritte 2.9 bis 2.10 wiederholt werden. - Die Zellpellets werden in 150 μl FACS-Puffer + 0,5 % Reinigungsmittel resuspendiert und bis zu zwei Tage lang lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.
- Die Zellpellets werden mit 150 μl FACS-Puffer + 0,5 % Detergens, ergänzt mit 5 μg/mL4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), resuspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubiert. Die Platte wird bei 400 x g 5 min bei 4 ΰC zentrifugiert. Der Überstand wird wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3) entsorgt.
- Die Zellpellets werden in 150 μl PBS resuspendiert und in ein entsprechend gekennzeichnetes FAC-Röhrchen überführt. Bis zur Analyse bei Raumtemperatur lichtgeschützt lagern.
HINWEIS: Nach der Resuspension in PBS sollten die Zellen innerhalb weniger Stunden analysiert werden, da sich das DAPI langsam von der DNA dissoziiert, was zu einem Signalverlust führt.
3. Einrichtung der Durchflusszytometrie und Durchführung von Proben
- Stellen Sie sicher, dass das Durchflusszytometer mit den entsprechenden Lasern und/oder Filtersets ausgestattet ist, um die Fluorophore zu messen, die zur Färbung der Zellen verwendet werden. Dies kann unter der Standardkonfiguration des Zytometers auf dem System bestimmt werden. Im Falle dieses Protokolls wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer analysiert, das mit drei Lasern (405 nm, 488 nm und 633 nm) ausgestattet war, die den Nachweis von ≤ 5 Fluorophoren ermöglichten.
- Wählen Sie die geeigneten Kanäle für die Detektion von Fluorophoren von Interesse. Alle Fluoreszenzsignale lassen sich am besten mit logarithmischer Verstärkung nachweisen.
- Wählen Sie eine geeignete Durchflussrate für die Proben aus. Dieser Parameter kann je nach verwendetem System variieren und sollte empirisch ermittelt werden. Im Falle dieses Protokolls wurde eine Flussrate von MED-zu-HI (35-60 μL/min) verwendet, um ein Verstopfen der Nadel zu verhindern.
- Wählen Sie die Gesamtzahl der Ereignisse/Zellen aus, die pro Probe erfasst werden sollen. Die Mindestanzahl von Ereignissen sollte 1.000.000 betragen.
- Erstellen Sie Streudiagramme unter einem globalen Arbeitsblatt der seitlichen Streufläche (SSC-A) im Vergleich zur vorderen Streufläche (FSC-A) sowie für jedes Fluorophor von Interesse im Vergleich zu FCS-A. Erstellen Sie eine Statistikansicht, in der die Anzahl der Ereignisse und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für die ausgewählten Fluorophore angezeigt werden.
- Stellen Sie die Spannung der FSC-A- und SSC-A-Kanäle so ein, dass die kleinsten Zellen in die unteren linken 10 % des Streudiagramms passen. Bestimmen Sie die Hintergrundfluoreszenz und die minimale Probenfluoreszenz von den ungefärbten Kontrollen entweder von den Ischiasnerven oder von den DRGs. Bestimmen Sie das übergeordnete (P1) Gate basierend auf dem Streudiagramm von reinen DAPI-Färbekontrollen.
HINWEIS: Dies ist kein Sammeltor, was zum Teil auf die heterogene Natur der DAPI+-Population im peripheren Nervensystem (PNS) zurückzuführen ist. - Unter Verwendung der FSC-Streudiagramme für jedes der interessierenden Fluorophore passen Sie die Spannungen so an, dass die Zellen der ungefärbten Kontrolle innerhalb des unteren Viertels ihrer jeweiligen Streudiagramme liegen. Über dieser Region werden dann Gates erstellt, um die Zellen zu definieren, die für jeden der jeweiligen Marker/Fluorophore positiv sind. Die Platzierung eines Angusses wird durch Ausführen der einfach gefärbten Kontrolle (Schritt 2.1) bestätigt.
HINWEIS: Die Kompensation von überlappenden Emissionsspektren kann an dieser Stelle durchgeführt oder mit der entsprechenden Analysesoftware nachträglich angewendet werden. - Sobald das Durchflusszytometer wie beschrieben eingerichtet ist, können die Proben entnommen werden.
- Nach dem Lauf kann das verbleibende Probenmaterial verworfen und die FCS-Dateien zur weiteren Analyse exportiert werden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Mouse style='color:#1a202c;font-size:12pt;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Charles River | |||
| DMEM (+1g/L Glukose, Glutamin, Pyruvat) | |||
| HEPES | |||
| Rinderserumalbumin (BSA) | |||
| Collagenase Type 4 | |||
| Desoxyribonuklease (DNase) I aus der Rinderpankreas I | |||
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)< | |||
| Fötales Kälberserum (FCS), hitzeinaktiviert | |||
| Antikörper gegen CD11b-PerCP/Cy5.5< | |||
| Antikörper gegen MHC Klasse II, biotinyliert | |||
| Antikörper gegen CD45-A647< | |||
| Streptavidin-PE/Cy7 | Wird verwendet, um MHCII-Biotin mit CD45-A647 und CDllb-PerCP/Cy5.5< | ||
| Triton-X 100< | |||
| DAPI< | |||
| Zelldissoziationssieb - Tissue Grinder Kit | |||
| V-förmige, 96-Well-Platten | |||
| 5ml Polystryen Tube mit rundem Boden, 12x75mm | |||
| 60x15mm Petridish | |||
| BD LSR II Flow Cytometer< |
