In diesem Video demonstrieren wir die Verwendung der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) im Spektralbereich zur Abbildung von Netzhautschichten und zur Beurteilung struktureller Veränderungen in einem genetisch veränderten Mausmodell mit Optikusneuropathie.
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Methodenartikel
In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.
1. Vorbereitung der Maus
- Augenerweiterung und Immobilisierung
- Mindestens 15 Minuten vor der Datenerfassung 10% Phenylephrin Augentropfen in die Augen der Maus träufeln, den Überschuss entfernen, und träufeln 0,5% Tropicamid Augentropfen.
HINWEIS: Die erste Dilatation kann für alle Mäuse, die in der Sitzung getestet werden, auf einmal durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeiten Raumtemperatur haben. - Unmittelbar nach Einleitung der Vollnarkose (Schritt 1.2) verabreichen Sie 0,4% Oxybuprocainhydrochlorid-Augentropfen und halten Sie sie 3 s lang an Ort und Stelle, um die Augen zu betäuben und zu immobilisieren. Wischen Sie anschließend die Tropfen ab und wiederholen Sie die Instillation von 10 % Phenylephrin und 0,5 % Tropicamid, um sicherzustellen, dass die Augen gut geweitet sind.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeiten Raumtemperatur haben und dass die Maus das Oxybuprocain nicht schluckt.
- Mindestens 15 Minuten vor der Datenerfassung 10% Phenylephrin Augentropfen in die Augen der Maus träufeln, den Überschuss entfernen, und träufeln 0,5% Tropicamid Augentropfen.
- Vollnarkose
- Bereiten Sie eine Anästhesielösung aus Ketamin (20 mg/ml) und Xylazin (1,17 mg/ml) in Kochsalzlösung vor. Bei 4 °C für maximal 2 Wochen lagern.
- Etwa 5 Minuten vor dem Test intraperitoneal 5 - 10 μl Anästhesielösung pro 1 g Körpermasse injizieren, abhängig vom Alter und der Größe der Maus.
HINWEIS: Junge und/oder dünne Mäuse benötigen weniger Betäubungsmittel, brauchen weniger Zeit zum Betäuben, wachen aber auch schneller auf. Hier 8 μL/g (160 mg/kg Ketamin, 9,33 mg/kg Xylazin). - Optional können Sie die Augen mit viskosen Augentropfen oder einem Augengel eincremen, um Trockenheit der Hornhaut zu vermeiden.
2. Positionierung der Maus
- Schmieren Sie die Augen mit viskosen Augentropfen auf Glykolbasis, um die Hornhaut mit Feuchtigkeit zu versorgen.
HINWEIS: Wenn die Augen während der Untersuchung trocken erscheinen, tragen Sie die Augentropfen erneut auf. - Wickeln Sie die Maus in ein Blatt chirurgische Gaze, um sie warm zu halten.
- Tragen Sie mit einem Schwamm oder einem Wattedocht eine dünne Schicht eines Augengels mit 0,3 % Hypromellose auf jedes Auge auf, um Lichtbrechung zu minimieren, Trübungen zu vermeiden und die Hornhautfeuchtigkeit zu gewährleisten. Schieben Sie dabei die Wimpern und Schnurrhaare zur Seite.
- Positionieren Sie die Maus mit geradem Kopf und nach vorne zeigend in der Kassette.
- Öffnen Sie vorsichtig die Beißstangenklemme und legen Sie die Stange in den Mund; Verwenden Sie den Nasenbügel, um die Position zu sichern.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Bissstange in der Mitte der Kassette befindet. - Legen Sie eine Watterolle unter die rechte (linke) Seite, wenn das rechte (linke) Auge getestet wird.
- Halten Sie die aufsteckbare Zielspitze auf dem mausspezifischen Objektiv und richten Sie sie in Richtung Auge, indem Sie die Z-Translator-Schraube gegen den Uhrzeigersinn drehen.
- Durch Drehen und Schwenken der Kassette und durch Drehen der Beißleiste und der X-Translator-Schrauben können Sie die Position der Maus voreinstellen; Ziel ist es, dass das richtige Auge direkt in die Linse schaut und so die optischen Achsen der Augen und der Linse ausgerichtet werden.
HINWEIS: Wenn die Maus zu hoch oder zu niedrig ist, sollte zuerst die Y-Translator-Schraube verwendet werden. - Wählen Sie in der "Untersuchung" den ersten Scan aus, klicken Sie auf "Zielen starten" und nehmen Sie weitere manuelle Anpassungen für die Netzhautbildgebung vor.
- Bewegen Sie die Netzhaut mit der Z-Translator-Schraube vertikal auf dem linken Feld (Abbildung 1, Horizontale B-Bildausrichtung) und horizontal auf der rechten Seite (Abbildung 1, Vertikale B-Bildausrichtung).
- Drehen Sie die Kassette, um den ONH in die Mitte des rechten Panels zu bringen, indem Sie den ONH nach oben oder unten bewegen. Verwenden Sie die Beißstangenschraube, um die Netzhaut auf der rechten Platte zu begradigen. Schwenken Sie die Kassette, um den ONH in der Mitte der linken Abdeckung zu positionieren.
- Verwenden Sie die X-Translator-Schraube, um die Netzhaut auf der linken Seite zu nivellieren. Unter Berücksichtigung der Hauptfunktion jedes Modulators passen Sie die Position der Netzhaut weiter an, um das ONH zu zentralisieren.
HINWEIS: Verwenden Sie die Y-Translator-Schraube, um den ONH auf der rechten Platte nach oben und unten zu bewegen, falls erforderlich. Die Position kann zwischen den Scans jederzeit angepasst werden.
3. SD-OCT-Bildgebung des ONH und der Netzhaut
- Sobald Sie mit den Anpassungen zufrieden sind, klicken Sie auf "Snapshot starten", um den SD-OCT-Scan zu starten.
- Wenn eine 3D-Bildgebung nicht erforderlich ist, deaktivieren Sie die Option OCU.
- Speichern Sie den Scan und den Bericht.
- Fahren Sie mit den nächsten Scans fort.
- Um das zweite Auge abzubilden, drehen Sie die Kassette nach dem Einfahren des Objektivs entsprechend und wiederholen Sie die Schritte 2.6 - 3.3.
4. Abschluss der Erfassung
- Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Maus aus der Kassette, tragen Sie ein ophthalmisches Gel mit 0,3 % Hypromellose auf jedes Auge auf und legen Sie die Maus zum Aufwachen auf eine Heizplatte.
- Schließen Sie nach der letzten Erfassung die Software und schalten Sie den Computer und das OCT-Gerät aus (Netzteiltaste).
- Reinigen Sie die Kassette mit Desinfektionsmittel.
5. Analyse
- Für die Messung der Netzhautschichtdicke verwenden Sie die vom Hersteller bereitgestellte automatisierte Segmentierungssoftware.
- Klicken Sie auf "Patient", wählen Sie die gewünschte "Untersuchung" aus der Liste aus und klicken Sie auf die Option "Prüfung überprüfen".
- Laden Sie die gewünschten OCT-Daten in die OCT-Software, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Ordnersymbol im gewünschten Scan klicken. {{}}
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den B-Scan; Konfigurieren Sie die Messschieber, indem Sie bis zu 10 Messschieber aktivieren. und geben Sie deren Namen, Winkel und Farben ein.
- Auswahl des gewünschten Messschiebers durch einen Rechtsklick auf das B-Bild; Legen Sie es entsprechend zur Messung auf die Netzhaut.
HINWEIS: Für die Scans, die auf dem ONH zentriert sind, stellen Sie 5 Messschieber auf jeder Seite ein, die gleich weit voneinander entfernt sind. Achten Sie bei der peripapillären Analyse darauf, dass der Messschieber nicht zu weit vom ONH entfernt platziert ist. Analysieren Sie für das radiale Scannen 10 Bilder pro Scan, die von der OCT-Software ausgewählt wurden. Ihre Nummern finden Sie im Ordner "Berichte". - Speichern Sie die Ergebnisse für die Analyse in einer Tabellenkalkulationssoftware, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den B-Scan klicken und auf "Ergebnisse speichern" klicken.
HINWEIS: Die Ergebnisse befinden sich im selben Ordner wie die Scandaten.
- Alternativ können Sie auch das selbstgebaute Messschieber-Makro "MRI Retina Tool" verwenden, das für ein Open-Source-Bildverarbeitungsprogramm entwickelt wurde (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie sicher, dass die Makros "MRI Retina Tool" und "Modify Polygon Section Tool" aktiv sind. Laden Sie das Bild. Klicken Sie auf die Schaltfläche m, um die Messung zu starten.
HINWEIS: Das Makro erstellt automatisch eine 0,2 mm lange Messkassette auf beiden Seiten des ONH. Jede Kassette enthält 5 Messpunkte, die als Messschieber fungieren. Ihre laterale Position ist unveränderlich und wird für die Peripapille in den radialen Scans angepasst. Die horizontale Position der Kassetten ist vordefiniert, um die RNFL/GCL-Dicke zu messen, aber sie ist leicht zu modifizieren, um stattdessen die komplexe GC-Schicht zu messen. Wenn die Scanqualität schlecht ist, muss die horizontale Position angepasst oder das Bild aus der Analyse ausgeschlossen werden. - Für die horizontale Anpassung klicken Sie auf die Schaltfläche e. Wählen Sie im neu geöffneten Fenster "ROI Manager" die erste Kassette aus.
- Klicken Sie auf die blaue Polygon-Schaltfläche und passen Sie die Position der ersten Kassette an, indem Sie auf die Ränder der gemessenen Schicht im Bild klicken.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Kassette, indem Sie diese zuerst im Fenster "ROI-Manager" auswählen und dann auf das entsprechende Bild klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche r, um erneut zu messen. Zeigen Sie die Ergebnisse im Fenster "Messungen" an.
HINWEIS: Die Ergebnisse können jederzeit in ein Tabellenkalkulationsprogramm kopiert werden. Sie enthalten die folgenden Werte für die rechte Kassette (r), die linke Kassette (l) und gesamt: Intden - integrierte Dichte innerhalb der Kassette; Fläche: Fläche der Messung, in mm2; Len: Länge des Messschiebers innerhalb der Kassette, in mm; Mittelwert: mittlere Intensität des Signals in der Kassette; und Std: Standardfehler der mittleren Intensität des Signals. - Fahren Sie mit dem nächsten Bild fort.
- Analysieren Sie die Daten in einer Tabellenkalkulationssoftware weiter.
HINWEIS: Um die mittlere Dicke der Schicht zu ermitteln, nehmen Sie die zehn Len-Werte.
- Stellen Sie sicher, dass die Makros "MRI Retina Tool" und "Modify Polygon Section Tool" aktiv sind. Laden Sie das Bild. Klicken Sie auf die Schaltfläche m, um die Messung zu starten.
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Ergebnisse
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mäuse | |||
| Opa1delTTAG mouse | |||
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software< | |||
| ImageJ 1.48v | Software für die Analyse, erfordert das Herunterladen und Installieren von zwei hausgemachten Makros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool | ||
| Selbstregulierende Heizplatte | |||
| Supplies< | |||
| Mullblöcke 3"x3" | |||
| Dual Ended Cotton tip applicator< | |||
| Cotton Twists< | |||
| Reagenzien und Medikamente | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | |||
| Mydriaticum 0.5% | |||
| Cebesine 0.4% | |||
| Imalgene 1000< | |||
| NaCl 0,9% | |||
| Systene Ultra | |||
| GenTeal' | |||
| Aniospray Surf 29 |
