Zeitraffer-Bildgebung der radialen Migration kortikaler Neuronen in transduzierten embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Wiegreffe, C., et. al., Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Schnittkultur des embryonalen Mausgehirns unter Verwendung von In utero{ Elektroporation. {{}}J. Vis. Exp.{{TAG_ 44}} (2017)

Dieses Video zeigt die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die radiale Migration kortikaler Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte über radiale Gliagerüste in transduzierten embryonalen Hirnschnitten der Maus zu beobachten.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung von Tieren überprüft und genehmigt.

1. Zeitrafferaufnahme

1. Mikroskop-Setup
   1. Stellen Sie eine Klimakammer auf dem Tisch eines inversen Konfokalmikroskops auf 37 °C und 5 % Kohlendioxidatmosphäre ein. Verwenden Sie einen Hybriddetektor, um die Laserintensität zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Verwenden Sie für eine detaillierte Analyse ein 40-faches Trockenobjektiv mit extra langem Arbeitsabstand und einer numerischen Apertur von 0,6 oder höher.
      Hinweis: Alle Komponenten des Mikroskops müssen vor der Bildgebung 2 - 3 Stunden lang auf 37 °C vorgewärmt werden, um einen stabilen Fokus während des Bildgebungsprozesses zu gewährleisten.
2. Schichtbildgebung
   1. Wählen Sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop einen Hirnschnitt für die Bildgebung aus der 6-Well-Platte mit den Membraneinsätzen aus.
      Vorsicht: Vermeiden Sie eine längere Belichtungszeit gegenüber ultraviolettem Licht, da dies zu zellulären Lichtschäden führen kann.
      HINWEIS: Wählen Sie eine Schicht mit hellen einzelnen Neuronen in der oberen SVZ (Subventrikuläre Zone), die radial zur Pialoberfläche der Schicht wandern. Feine fluoreszierende Fortsätze radialer Gliazellen, die sich über die gesamte CP (Kortikale Platte) erstrecken, deuten auf ein intaktes radiales Gliagerüst hin, das von radial wandernden kortikalen Neuronen genutzt wird.
   2. Den Membraneinsatz mit der Scheibe, die für die Zeitraffer-Bildgebung ausgewählt wurde, wird mit Hilfe einer Pinzette in eine Glasbodenschale mit einem Durchmesser von 50 mm mit 2 ml Scheibenkulturmedium überführt. Stellen Sie die Schale in die Klimakammer des Konfokalmikroskops.
   3. Stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel ein und erhöhen Sie die Scangeschwindigkeit von 400 Hz auf 700 Hz, um die Bildrate von ca. 1,4 auf ca. 2,5 Bilder pro Sekunde zu erhöhen. Verwenden Sie nicht mehr als die zweifache Mittelwertbildung. Definieren Sie einen z-Stapel durch den elektroporierten Bereich (in der Regel 400-100 μm) mit einer Schrittweite von 1,5 μm. Zusammen ermöglichen diese Einstellungen eine ausreichende Auflösung und Helligkeit des Bildes, während der Lichtschaden während der Aufnahme gering gehalten wird. Beginnen Sie die Zeitrafferserie, indem Sie alle 30 Minuten einen Z-Stapel aufnehmen.
      HINWEIS: Eine längere Exposition der Schicht gegenüber Laserlicht führt zu Lichtschäden, die die Lebensfähigkeit der Zellen verringern. Passen Sie die Belichtungszeit auf Laserlicht entsprechend an.
   4. Analysieren Sie Zeitrafferreihen mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/iij/) oder einer gleichwertigen Software.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-well plate<	351146
Invertierte Fluoreszenz-Gewebekulturmikroskop<	DM IL LED
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica<
Hybrid detector	Leica	HyD
Objective, 40x/0.60 NA	Leica	11506201
Temperaturkontrollsystem für das Mikroskop	Life Imaging Services	Cube, Brick & Box
Zellkultur-Einfügung	Millipore	PICM0RG50<
Microgrinder<	EG-45	Verwende einen 38°-Winkel zum Abschrägen
Microinjector	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III
Pinzette mit 5 mm Platin-Disk-Elektroden<	CUY650P5
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97<
Box filament	Sutter Instrument	FB255B<
Micro-spoon spatula	VWR	231-0191	185 mm x 5 mm
Glasboden, 50 mm<	FD5040-100<

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