Selektive Einzelneuronen-Laserablation an einer Zebrafischlarve mit einem konfokalen Mikroskop

Zusammenfassung

Quelle: Morsch, M., et. al., Auslösen von Zellstress und Zelltod mit konventioneller konfokaler UV-Lasermikroskopie. J. Vis. (2017)

In diesem Video untersuchen wir die Technik der hochintensiven UV-Laserablation zur präzisen Ausrichtung und Untersuchung einzelner Neuronen in transgenen Zebrafischen. Wir zeigen, wie man neuronale Reaktionen vorbereitet, immobilisiert und visualisiert, und heben die zelluläre Dynamik von Verletzung und Genesung hervor.

Protokoll

1. Bereiten Sie Lösungen für die Einbettung von Zebrafischen in Agarose vor.
   1. Bereite eine Anästhesielösung vor, indem du 4 g/L MS222 (Tricain-Stammlösung, pH 7,0) tropfenweise in eine Petrischale mit Eiwasser gibst. Eine Dosis von 50 mg/L ist ein empfohlener Ausgangspunkt (Figure 1A).
   2. Bereiten Sie eine Brühe mit niedrigschmelzender Agarose (0,8 - 1,5 %) in Eiwasser vor und aliquotieren Sie sie in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie ein Aliquot in einen vorgeheizten Heizblock (38 - 40 °C) und lassen Sie es auf die eingestellte Temperatur (~ 30 min; Figure 1B).
   3. Optional: Für eine längerfristige Bildgebung (> 4 h) bereiten Sie in der 35-mm-Petrischale mit Glasboden einen kleinen Agarosekreis vor und lassen Sie ihn aushärten.
      HINWEIS: Dieser zusätzliche Schritt war effektiv, um eine Bewegung des gesamten Agarosetropfens mit dem Zebrafisch über längere Zeiträume zu vermeiden.
      1. Um dies zu tun, platzieren Sie ~ 300 μl Agarose entlang des inneren Kreises der Glasbodenschale, um einen Donut-förmigen Kreis mit einer kleinen Öffnung in der Mitte vorzubereiten, in den der Fisch gelegt wird (Schritt 1.5.3).
2. Montieren Sie den Zebrafisch für die Mikroskopie in Agarose.
   1. Wählen Sie 1 - 3 der vorgescreenten Fische für die Ablation aus und betäuben Sie die Larven, indem Sie sie (mit einer Transferpipette) in eine Schale mit der Anästhesielösung übertragen (Schritt 1.4.1; Figure 1C; ca. 5 min).
      HINWEIS: Die Fische werden betäubt, wenn sie eine flache operkuläre Bewegung und eine verminderte Herzfrequenz zeigen und keine berührungsevozierte Fluchtreaktion mehr zeigen (TEER; Nichtschwimmen nach sanfter Berührung des Schwanzes mit einer Bürste). Stellen Sie eine angemessene Anästhesie sicher, um die ethische Behandlung der Fische zu gewährleisten und ein Zucken beim Transfer in Agarose oder bei der Einwirkung von Fluoreszenzlicht zu verhindern.
   2. Nachdem die Anästhesie bestätigt wurde, saugen Sie eine Larve mit einer verstellbaren Pipette auf (mit einer abgeschnittenen 200-μl-Spitze auf ~ 30 μl) und lassen Sie sie bis zum Boden der Spitze sinken. Übertragen Sie die Larve in vorgewärmte Agarose (Schritt 1.4.2), indem Sie einen Tropfen der Flüssigkeit mit der Larve in die Agarose abgeben (versuchen Sie, die Menge an Eiwasser, die in die Agarose gelangt, zu minimieren; Figure 1D<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>).
   3. Saugen Sie den Fisch umgeben von Agarose auf. Geben Sie es schnell in die zuvor vorbereitete 35-mm-Glasbodenschale.
   4. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop und einen Standard-Pinsel (Long Liner, Größe 1), um das Tier in der Agarose an der Seite (Kopf nach links) zu positionieren, so dass Körper und Schwanz flach sind (Abbildung 1E). Wenn Sie mit mehreren Fischen arbeiten, richten Sie alle Fische in der Schüssel so aus, dass sie später mit dem Konfokalmikroskop leicht lokalisiert werden können.
      HINWEIS: Führen Sie diesen Vorgang des Positionierens und Ausrichtens schnell durch (es kann etwas Übung erfordern, da die Agarose sofort nach dem Einwirken kälterer Temperaturen zu erstarren beginnt).
   5. Lassen Sie den in Agarose eingebetteten Fisch 10 - 15 Minuten stehen, bis die Agarose fest ist. Füllen Sie die 35-mm-Petrischale vorsichtig mit ~ 2 ml Eiwasser auf, das Tricain enthält (Figure 1F).

2. Einrichten der Parameter für das konfokale Mikroskop und die Bildgebung

1. Platzieren Sie die Petrischale mit der eingebetteten Larve auf dem konfokalen Mikroskoptisch und fokussieren Sie sich auf die dorsale Seite des tierischen Rückenmarks (mit Hellfeld). Untersuchen Sie das Tier unter der entsprechenden Vergrößerung (40X) und Fluoreszenzeinstellung und visualisieren Sie die gewünschte Struktur (z.B., die Fluoreszenzintensität der markierten Neuronen oder der Mikrogliabewegung), um zu bestätigen, dass alle Bildgebungsparameter für die nachfolgende Ablation erforderlich sind (Abbildung 2). Wir verwenden routinemäßig das 40X-Objektiv, um unsere Zeitrafferstudien durchzuführen.
2. Optional: Um eine Zeitrafferstudie über mehrere Stunden durchzuführen, ist es ratsam, einen einzelnen oder einige Zeitpunkte vor der Ablation aufzuzeichnen, um die ungestörte physiologische Reaktion der Zelle und ihrer Umgebung zu ermitteln (z.B. Mikroglia-Bewegung, um die Geschwindigkeit und Motilität der Grundlinie zu bestimmen).
3. Bestimmen Sie die Dicke der Struktur, die für die UV-Laserablation von Interesse ist.
   1. Überprüfen Sie mit dem Z-Laufwerk den oberen und unteren Rand der gewünschten Struktur (zB das Zell-Soma), indem es manuell nach oben und unten fokussiert. Notieren Sie sich die Z-Ebene, die abgetragen wird (z.B., der Mitte der Zelle).
      HINWEIS: Erfahrungsgemäß war diese Methode am effektivsten, indem sie auf hell markierte Rückenmarksneuronen abzielte (ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, das eine einfache Visualisierung des Zeitraffers nach der Ablation ermöglicht; z.B., Figure 4) und durch Ablation der Mitte des Zellsomas. Die Zellkernfluoreszenz kann von Vorteil sein, um eine korrekte Ausrichtung und eine hohe Ablationseffizienz zu gewährleisten.

3. Führen Sie eine gezielte Laserablation einzelner Zellen im Zebrafisch durch Spinal Cord

HINWEIS: Für diesen Ablations- und Visualisierungsansatz wurde ein konfokales Mikroskop (Leica SP5) verwendet. Das Ablationsverfahren mit einer 405-nm-Diode zur zellspezifischen Zerstörung ist in der Software (Leica Application Suite, v2.7.3.9723) detailliert beschrieben. Jedes herkömmliche konfokale Mikroskop, das mit einem 405-nm-Laser und einem FRAP (Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleaching) oder Bleichmodul ausgestattet ist, ermöglicht jedoch die Durchführung der gleichen Zellmanipulationen, jedoch möglicherweise mit leicht unterschiedlichen Einstellungen, Parametern und Namen.

1. Starten Sie den FRAP-Assistenten, indem Sie auf das Dropdown-Menü oben im Software-Menü klicken (Abbildung 3A, 1 and 2). Beobachten Sie ein neues Fenster mit verschiedenen Schritten, das die Einrichtung der spezifischen Parameter für die Laserablation ermöglicht (Abbildung 3B, 3).
2. Bestimmen Sie die Bildparameter für den Ablationsansatz, indem Sie das Format und die Scangeschwindigkeit auswählen (Abbildung 3B, 4), und Mittelwertbildung (Abbildung 3B, 5). Ein Bildformat von 1.024 x 1.024 bei einer Scangeschwindigkeit von 400 Hz und einem Zeilendurchschnitt von 4 war am besten geeignet.
   HINWEIS: Es ist in der Regel nicht erforderlich, die spektrale Detektion (wie z. B. die Anregungs- oder Emissionsparameter) zu ändern, da sie bei der vorherigen Erfassung bestimmt wurden.
   1. Wenn die Z-Ebene für die Ablation noch nicht ausgewählt wurde (wie in Schritt 2.4 beschrieben), drücken Sie die "Live"-Taste und fokussieren Sie durch die Probe, bis die fluoreszierende Struktur oder die gewünschte Z-Ebene, die abgetragen werden soll, scharf ist.
3. Sobald die allgemeinen Bildparameter eingestellt sind, greifen Sie auf den Schritt "Bleach" zu (Abbildung 3C, 6), um die spezifischen Ablationskomponenten zu steuern.
   HINWEIS: A Kombination der Laserintensität (Figure 3C, 8), die Scangeschwindigkeit und die Mittelwertbildung, die in Schritt 3.2 eingestellt wurde (Figure 3B, 4 und 5), sowie die Anzahl der Wiederholungen, die in Schritt 3.5 festgelegt werden (Abbildung 3E, 12), bestimmt die Gesamtverweilzeit des UV-Lasers bei der ROI und damit die Bleicheffizienz.
   1. Aktivieren Sie den 405-nm-Laser, indem Sie ihn für das Bleaching-Verfahren aktivieren (Abbildung 3C, 8).
      HINWEIS: Die meisten Erfolge mit den oben genannten Einstellungen wurden mit 405-nm-Laserintensitäten zwischen 60 und 80 % in unserem Versuchsaufbau erzielt. Beachten Sie, dass diese Laserleistung gerätespezifisch ist und für jedes konfokale Setup unterschiedlich ist.
   2. Verwenden Sie die Option "zoom in" (Figure 3C, 7) Maximierung der Bleichintensität bei gewähltem ROI durch Reduzierung des Scanfeldes und damit Maximierung der Verweilzeit. Alternativ können Sie für diesen Vorgang die Option "Bleichpunkt" der Software Ihrer Wahl verwenden.
4. Wählen Sie einen oder mehrere ROIs aus (Figure 3D, 10<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>) für die Ablation mit einem der Zeichenwerkzeuge im Bildaufnahmefenster (Figure 3D, 9). Zielen Sie z.B. mit dem kreisförmigen Zeichenwerkzeug von ca. 4 - 8 μm auf den Axonhügel ab.
   HINWEIS: Der Ablationsbereich ist je nach Anwendung von einem einzelnen Pixel bis zu einem größeren Bereich einstellbar.
5. Nachdem Sie den ROI festgelegt haben, wählen Sie die Schaltfläche "Zeitverlauf" (Figure 3E, 11) und bestätigen Sie die Anzahl der Zyklen, in denen die ROIs gescannt/abgetragen werden (Figure 3E<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>, 12<span style='font-family:Arial,sans-serif; Schriftgröße:12pt; font-style:normal; font-variant:normal; Schriftstärke:400; text-dekoration:keine; vertical-align:Grundlinie; white-space:pre-wrap;' >). Wählen Sie je nach Wunsch die Rahmen "Pre-Bleach" und "Post-Bleach", um kurz vor und unmittelbar nach dem Bleaching-Prozess einen Überblick über das Gesamtbild zu ermöglichen.
6. Nachdem Sie alle erforderlichen Ablationsparameter festgelegt haben, drücken Sie auf "Run Experiment" (Abbildung 3E, 13) und überwachen Sie die Effizienz der Ablation.
   HINWEIS: In unserem FRAP-Setup wird ein einzelnes Bild vor und nach dem FRAP-Zyklus mit der entsprechenden Laseranregung aufgenommen (z.B., 488-nm-Anregung für EGFP-exprimierende Zellen). Diese Bilder vor und nach der Ablation ermöglichen eine schnelle Beurteilung, wie zufriedenstellend der ROI gebleicht wurde und wie effektiv die gewählten Ablationsparameter waren.
7. Wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie die Laserintensität anpassen (Figure 3C, 8), Scangeschwindigkeit und Mittelwertbildung (Figure 3B, 4 und5) und Wiederholungen (Figure 3E<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>, 12) falls der ausgewählte ROI nach Abschluss des FRAP immer noch eine hohe Fluoreszenzintensität aufweist Zyklus.

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