Bildgebung von Polysomen, die aus einem Mausgehirn isoliert wurden, mittels Rasterkraftmikroskopie

Abstract

Quelle: Lunelli, L., et. al. Blick auf Gehirnpolysomen mit Rasterkraftmikroskopie. J. Vis. Exp.(2016).

Dieses Video zeigt die Bildgebung von Polysomen mittels Rasterkraftmikroskopie. Ein mit Nickelionen beschichtetes Glimmerblatt verankert RNA mit angehängten Ribosomen. Die Probe wird gewaschen, getrocknet und auf den Mikroskoptisch montiert. Die Cantilever-Spitze tastet die Probenoberfläche ab und zeichnet Laserablenkungen auf, um die Topologie abzubilden. Software wird eingesetzt, um Verzerrungen zu korrigieren und hochauflösende Polysomenstrukturen sichtbar zu machen.

Protocol

Vorsicht: Um einen RNA-Abbau der Proben zu vermeiden, bereiten Sie alle Puffer mit DEPC-behandeltem Wasser vor, um eine RNase-Kontamination zu minimieren.

1. Präparation von Polysomen aus ganzen Gehirnen

1. Sammeln von Hirngewebe (15 min)
   1. Einschläfern des Wildtyp-Mausstamms C57BL/6 mit CO₂ Erstickung für 5 min. Präparieren Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel, geben Sie das Gewebe in ein 1,5-ml-Röhrchen und legen Sie es sofort in flüssigen Stickstoff. Bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
2. Zubereitung von Lysat (30 min)
   1. Das gesamte Hirngewebe mit einem Mörser und Stößel unter flüssigem Stickstoff pulverisieren.
   2. Füllen Sie etwa 25 mg Pulver in ein kaltes Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie sofort (um ein Auftauen des pulverisierten Gewebes zu vermeiden) 0,8 ml Lysis Buffer hinzu (siehe Tabelle 1) und unterbrechen Sie die Zelle, indem Sie 25 Mal schnell auf und ab pipettieren.
   3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für 1 min bei 4 °C, um Zellreste zu pelletieren.
   4. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie das Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis.
   5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C, um Kerne und Mitochondrien zu pelletieren.
   6. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
   7. Lagern Sie den Überstand maximal 6 Monate bei –80 °C oder verwenden Sie ihn sofort.
3. Vorbereitung und Zentrifugation von Saccharosegradienten (2 Std. und 30 min)
   1. {{}}{TAG_109}}Waschen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen ausgiebig mit RNase-freiem Wasser (mit Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser (DEPC-Wasser) oder kommerziell) und 3 % H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O Lösung.
   2. Legen Sie die Röhrchen auf Eis und geben Sie 5,5 ml kalte 50%ige Saccharoselösung auf den Boden jedes Röhrchens (siehe Tabelle 1 für Saccharoselösungen). Die 15%ige Saccharoselösung wird vorsichtig tropfenweise zugegeben, wobei Sie in der Nähe der Zwischenphase bleiben, um eine scharfe Zwischenphase zu erhalten, bis die Tube vollständig gefüllt ist. Wenn das Rohr vollständig gefüllt ist, verschließen Sie es mit einem Gummistopfen, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   3. Legen Sie die Schläuche in einem kalten Raum vorsichtig waagerecht ab und halten Sie sie 2 Stunden lang in dieser Position. Nach dieser Zeit richten Sie die Rohre langsam wieder in die vertikale Position auf und legen Sie sie auf Eis. Die Farbverläufe können nun verwendet werden. Alternativ können Sie den 15-50%igen Saccharosegradienten mit einem herkömmlichen Gradientenformer herstellen.
   4. In einem Kühlraum wird vorsichtig 1,0 ml von der Oberseite des Gradienten entfernt und die Saccharose Tropfen für Tropfen mit dem zytosolischen Lysat (d. h. dem in Schritt 1.2 erhaltenen Überstand) überzogen.
   5. Senken Sie die Rohre vorsichtig in die Schaufeln des Ausschwingrotors ab. Zentrifugieren Sie die Gradienten 100 min lang bei 180.000 x g bei 4 °C mit einer Ultrazentrifuge.
   6. Lassen Sie die Röhrchen nach der Zentrifugation 20 min bei 4 °C in ihren Eimern, um die Gradienten zu stabilisieren.
4. Saccharosegradientenfraktionierung (2 Stunden)
   1. Entfernen Sie vorsichtig ein Ultrazentrifugenröhrchen aus dem Ultrazentrifugenrotor und montieren Sie es auf die Auffangvorrichtung eines Dichtegradientenfraktionierungssystems. Sammeln Sie 1-ml-Fraktionen, um die Extinktion bei 260 nm mit einem UV/VIS-Detektor zu überwachen (siehe Abbildung 1 obere Tafel). Bewahren Sie die gesammelten Fraktionen auf Eis auf.
   2. Aliquots von 30-40 μl der interessierenden Fraktionen werden vorbereitet. Bewahren Sie sie auf Eis auf, bevor Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Verwenden Sie keine Aliquote oder Saccharosefraktionen, die mehr als zwei Gefrier- und Auftauzyklen durchlaufen haben (siehe Abbildung 1 unteres Bild).

2. Probenvorbereitung für die Rasterkraftmikroskopie (3 Stunden)

1. {TAG_208}}Mit Klebeband die Glimmerblätter abziehen.
2. Waschen Sie die Glimmerblätter 3-4 Mal mit DEPC-Wasser und geben Sie sie in eine kleine Petrischale. Trocknen Sie dann die Oberfläche mit Luft.
3. Bedecken Sie den Glimmer mit 200 μl 1 mM NiSO₄ und inkubieren Sie 3 min bei RT.
4. Entfernen Sie die Nickellösung und trocknen Sie die Oberfläche dann an der Luft. Führen Sie alle weiteren Schritte bei 4 °C durch, indem Sie die Petrischale mit dem Glimmer auf Eis stellen.
5. Ein in Abschnitt 1.4.2 erhaltenes Aliquot wird auf Eis aufgetaut und die gesamte Probe wird vorsichtig tropfenweise auf den Glimmer gegeben. Verteilen Sie die Probe mit einer 100-200-μl-Spitze auf der gesamten Oberfläche des Glimmers. Inkubieren Sie die Probe 3 Minuten lang auf Eis.
6. Bedecken Sie die Glimmerplatte Tropfen für Tropfen mit 200 μl kaltem Puffer-AFM (siehe Tabelle 1) und inkubieren Sie 1 Stunde auf Eis.
7. Bildgebung in Flüssigkeit
   1. Entfernen Sie vorsichtig das Puffer-Rasterkraftmikroskop (AFM) und waschen Sie die Glimmerblätter 3-4 Mal mit 200 μl kaltem Puffer-AFM, um überschüssige Saccharose zu entfernen. Waschen Sie dann die Glimmerblätter 3 Mal mit einer kalten Waschlösung (siehe Tabelle 1{TAG_274}}), wobei die Glimmeroberfläche mit einigen Mikrolitern Lösung bedeckt bleibt.
   2. Gehen Sie zu Punkt 3 (Bildaufnahme).
8. Bildgebung an der Luft
   1. Entfernen Sie vorsichtig das Puffer-AFM und waschen Sie den Glimmer 3-4 Mal mit 200 μl kaltem Puffer-AFM, um die überschüssige Saccharose zu entfernen. Waschen Sie dann den Glimmer 3 Mal mit kalter Waschlösung (siehe Tabelle 1) und lassen Sie das überschüssige Wasser mit Papier abtropfen.
   2. Lassen Sie die Probe unter der chemischen Haube trocknen, wobei die Oberseite der Petrischale teilweise geöffnet ist. Nach 2 Stunden verschließen Sie die Petrischale und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT). Messen Sie die Probe nach 2-3 Stunden, da sie über Jahre stabil sind.

3. Bildaufnahme (15 min pro Bild nach thermischer Stabilisierung)

Hinweis: Auf Glimmer immobilisierte Polysomen können im AC-Modus an Luft oder in Flüssigkeit abgebildet werden.

1. Befestigen Sie den Glimmer mit doppelseitigem Klebeband am Probenhalter.
2. Setzen Sie den Probenhalter gemäß den Anweisungen des Herstellers in den AFM-Tisch ein. Versuchen Sie bei der Bildgebung in Flüssigkeit, wenn möglich, die Probe auf einer Temperatur von weniger als 25 °C zu halten, um die Stabilität des Polysoms rechtzeitig zu erhöhen.
3. Wählen Sie einen für die AC-Bildgebung geeigneten Ausleger und montieren Sie ihn gemäß den Anweisungen des Herstellers auf dem Spitzenhalter. Verwenden Sie hier Ausleger mit einer Kraftkonstante zwischen 2-20 N/m für die Luftbildgebung und etwa 0,1 N/m für die Flüssigkeitsaufnahme.
4. Justieren Sie den Laserpunkt auf dem Cantilever, und stellen Sie die Signale des Quadrantendetektors auf Null.
5. Wählen Sie eine passende Ansteuerfrequenz und treiben Sie den Ausleger mit einer Amplitude von 10-20 nm an.
6. Nähern Sie sich der Probe, bis die Spitze in die Oberfläche eingreift.
7. Wählen Sie einen Scanbereich von 2 x 2 μm, erfassen Sie Bilder mit mindestens 512 x 512 Pixeln (Pixelbreite < 4 nm) und wählen Sie einen Live-Hintergrundsubtraktionsmodus und eine Z-Skala von 20-25 nm.
8. Untersuchen Sie das Bild auf das Vorhandensein von runden Objekten, die durch eine Höhe zwischen 10 und 15 nm bei der Aufnahme in Luft und 25 und 30 nm bei Flüssigkeit und eine Breite im Bereich von 25-30 nm gekennzeichnet sind. Passen Sie die Sollwert- und Feedback-Parameter an, bis scharfe Objekte visualisiert werden. Der Hintergrund sollte in guten Stichproben relativ flach erscheinen, mit einigen Objekten mit einer Höhe von 2-4 nm (siehe Abbildung 2A und B).
9. Wenn das Bild gut aussieht (wie unter Punkt 3.8 angedeutet), machen Sie mehrere (mindestens zehn) 2x2-Mikron-Scans in verschiedenen Probenbereichen.
10. (fakultativ). Erfassen Sie bei Bedarf hochauflösende Bilder ausgewählter Polysomen (siehe Abbildung 2C).
11. Wenden Sie Software-Korrekturen (Ebenensubtraktion und zeilenweise Korrekturalgorithmen) an, um die AFM-Bilder zu korrigieren und willkürliche Neigungs- und Drifteffekte zu entfernen.

4. Datenanalyse (30 min pro Bild)

1. Exportieren Sie Bilder in ImageJ (optional: Skalieren Sie einen Skalierungsfaktor anwenden) vorzugsweise mit einem verlustfreien Komprimierungsformat, z.B. dem TIFF-Format (siehe Abbildung 3A).
2. Verwenden Sie das ImageJ-Makro-Toolset RiboPick.ijm (zum Kopieren in das Unterverzeichnis ImageJ macro/toolset), um Ribosomen in Polysomen zu zählen (siehe Abbildung 3B{TAG_440}}) und statistische Eigenschaften der Probe zu berechnen (siehe Abbildung 3C).
   1. Starten Sie das Laden eines Bildes mit dem Tool das das Programm initialisiert.
   2. Wählen Sie die Ribosomenzentren mit dem Standardwerkzeug ImageJ aus (Umschalt + Linksklick ermöglicht die Mehrfachauswahl von Ribosomen). Markieren Sie die ausgewählten Ribosomen mit dem Werkzeug . Die Ribosom-Koordinaten werden in einem benutzerdefinierten Textfenster angezeigt.
   3. Demselben Polysom werden weitere Ribosomen zugesetzt, wobei das in Nummer 4.2.2 beschriebene Verfahren wiederholt wird.
   4. Entfernen Sie falsch markierte Ribosomen mit dem Werkzeug (beginnen Sie mit dem Entfernen vom zuletzt hinzugefügten Ribosom zum ersten – nur im aktuellen Polysom).
   5. Wenn das Polysom fertiggestellt ist, verwenden Sie das Werkzeug . Wenn die Polysomennummer als Überlagerung zum Bild hinzugefügt wird, wird das Textfenster aktualisiert.
   6. Verwenden Sie die um die Ribosomenkoordinatendatei (es werden die Standardeinheiten des Bildes verwendet) und ein PNG-Bild zu schreiben, das die ausgewählten Ribosomen und Polysomen zusammenfasst. Das Originalbild wird geschlossen, ohne gespeichert zu werden.

Tabelle 1. Puffer.

10 mM Tris-HCl, pH 7.7.5

Puffer	Komposition	} Anwendung
Lysepuffer	Aufbereitung von Lysat (1.1)
	10 mM NaCl	{{TAG_ 577}}
	10 mM MgCl2
	1% Triton-X100
	1% Na-Desoxycholat
	0.4 U/ml RNase-Hemmer
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
	0..2 mg/ml Cycloheximid
	{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50%ige Saccharoselösung{{TAG_687 }}	50% (w/v) Saccharose in	Saccharose Vorbereitung des Gradienten (1.) 2)
	100 mM NaCl {{TAG_717 }}
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
{TAG_757{}}15%ige Saccharoselösung{	{{ TAG_764}}15% (w/v) Saccharose in	Saccharose-Gradientenpräparation (1..2)
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7..7.5
Nickellösung	1 mM NiSO{{TAG_840}4	Probenvorbereitung für AFM (2)
Puffer-AFM	100 mM NaCl	}{{}}}{{Probenvorbereitung für AFM (2)
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml Cycloheximid{TAG_908{ }}
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	3% (w/v) Saccharose pH = 7.7.4
Waschen Lösung	DEPC-Water	Probenvorbereitung für AFM (2)
	100 μg/ml Cycloheximid {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}{{}}{TAG_594}} {{ TAG_610}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials