Kontrastmittelverstärkte Mikro-CT-Bildgebung von zerebralen kavernösen Malformationsläsionen in einem Mausgehirn

Zusammenfassung

Quelle: Choi, J. P. et al.et al. Induktion und Mikro-CT-Bildgebung von zerebralen kavernösen Fehlbildungen im Mausmodell. J. vis. exp. ( 2017)

Dieses Video zeigt die Verwendung von Mikro-CT-Bildgebung zur Visualisierung von zerebralen kavernösen Malformationen (CCM) im Gehirn einer Maus. Es beschreibt die Schritte für die Probenvorbereitung, die Bildgebung und die 3D-Bildrekonstruktion, um die Dichte und Lokalisation von CCM-Läsionen im Hirngewebe zu bewerten.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Probenvorbereitung für Mikro-Computertomographie (CT)-Scans

1. Einschläferung von Neugeborenen bei P8 durch Kohlendioxid-Erstickung.
2. Führen Sie eine intrakardiale Perfusion durch, indem Sie eine 29-Gauge-Nadel mit 3 ml 2 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 10-ml-Spritze in den Ventrikel des Mausherzens einführen.
   CAUTION:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Paraformaldehyd ist giftig; Tragen Sie einen angemessenen Schutz.
3. Lösen Sie den Kopf mit einer Schere vom Körper. Entfernen Sie mit einer Schere die gesamte Haut vom Kopf und schälen Sie den Schädel mit einer Pinzette ab, um das gesamte Gehirn zu präparieren.
4. Nehmen Sie Bilder des Gehirns mit einem Stereomikroskop bei 7,82-facher Vergrößerung, 1-facher Verstärkung, 0,6 Gamma und 20 ms Belichtungszeit auf.
5. Fixieren Sie die präparierten Gehirne über Nacht mit 4% Paraformaldehyd in PBS-Lösung.
   CAUTION:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Paraformaldehyd ist giftig; Tragen Sie einen angemessenen Schutz.
6. Am nächsten Tag das Hinterhirn mit einer Pinzette abtrennen und mit PBS-Lösung waschen.
7. Inkubieren Sie das Hinterhirn 48 Stunden lang in Lugols Jodlösung.
8. Nach der Inkubation das Hinterhirn kurz an der Luft trocknen, um überschüssige Lugolsche Jodlösung zu entfernen.
9. Verpacken Sie das jodverschmierte Hinterhirn von Lugol in 0,65-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und versiegeln Sie es vollständig mit Kunststoff-Paraffinfolie, um ein Schrumpfen des Gewebes zu vermeiden (Abbildung 1A).
10. Legen Sie Mikrozentrifugenröhrchen in 5-ml-Kunststoffröhrchen mit Schwämmen, um zu verhindern, dass sie sich während des Scans bewegen (Abbildung 1B).

2. Mikro-CT-Scan von zerebralen kavernösen Fehlbildungen (CCMs) im Gehirn der Maus

1. Montieren Sie das in einer Röhre verpackte Hinterhirn vertikal auf einem Aluminiumhalter im Mikro-CT-System.
2. Stellen Sie die Scanparameter auf 540 Projektionen und 2 s Belichtungszeit bei Quellenbedingungen von 50 kV und 10 W ein, um die tomographischen Datensätze zu erfassen (Bildauflösung 9,5 μm/Pixel).
3. Die Röntgenbilder des Scans werden automatisch von der hardwarebasierten Projektionsrekonstruktionssoftware rekonstruiert, die vom Mikro-CT-System bereitgestellt wird, wodurch eine Bildserie von 16-Bit-Axialschichten ("TXM"-Datei) erstellt wird.

3. Analyse von Micro-CT-Datensätzen

1. Öffnen Sie die rekonstruierte Bilddatei ("TXM"-Datei) in der 3D-Analysesoftware und visualisieren Sie das Gehirn mit der Funktion "Volumen-Rendering".
2. Transformieren Sie das Hinterhirn mit den Funktionen "Bounding Box" und "Clipping Plane" in die gewünschte Ausrichtung.
3. Berechnen Sie das transformierte Bild im erweiterten Modus neu und behalten Sie die Voxelgröße bei.
4. Erstellen Sie ein "neues Beschriftungsfeld bearbeiten" auf dem transformierten Bild (3.3) und markieren Sie nur das Hinterhirn mit Graustufenintensität.
5. Fügen Sie die hervorgehobenen Bereiche hinzu und führen Sie "label analysis" durch, um Messungen des gesamten Hinterhirns zu erhalten (d.h., Gesamtvolumen und Fläche). Exportieren Sie Messungen in eine Excel-Datei.
6. Visualisieren Sie das Hinterhirn mit der Funktion "Isosurface Rendering".
7. Erstellen Sie ein weiteres "Neues Beschriftungsfeld bearbeiten" auf dem transformierten Bild und markieren Sie Bereiche mit Läsionen mithilfe der Graustufenintensität.
8. Fügen Sie die hervorgehobenen Bereiche hinzu und führen Sie eine "Beschriftungs"-Analyse durch, um Messungen der Läsionen im Hinterhirn zu erhalten (d.h., Gesamtvolumen und Fläche). Exportieren Sie Messungen in eine Excel-Datei.
9. Visualisieren Sie die Läsionen mit den Funktionen "Oberfläche generieren" und "Oberflächenansicht".
10. Machen Sie einen Schnappschuss der Bilder des Hinterhirns in der gewünschten Ausrichtung oder erstellen Sie einen Film zur 3D-Visualisierung der Läsionen.

Ergebnisse

Materialien