Dieses Video zeigt die Verwendung von Dual-Fluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Differenzierung von Oligodendrozyten aus Vorläuferzellen (OPCs), die aus dem Gehirn eines Rattenwelpen isoliert wurden. Der Prozess umfasst die Fixierung der Zellen, die Markierung spezifischer Marker mit primären und fluorophorkonjugierten Sekundärantikörpern und deren Visualisierung mittels Fluoreszenzbildgebung. Es werden differenzierte Oligodendrozyten identifiziert, die sowohl das Myelin-Basisprotein (MBP) als auch den Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2 (Olig2) exprimieren, was sie von undifferenzierten Vorläuferzellen unterscheidet, die nur Olig2 exprimieren.
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Methodenartikel
Duale Fluoreszenzbildgebung zur Identifizierung differenzierter Oligodendrozyten
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Vorbereitung von Assay-Platten, Stammlösungen und OPC-Basismedien<
p style='line-height:1.2; margin-bottom:0pt; margin-top:12pt;' dir='ltr'>Note: Das hier beschriebene Ratten-OPC-Base-Medium (Sato) wurde aus zuvor veröffentlichten Studien abgeleitet. Auch alternative Medienformulierungen können mit diesem Verfahren kompatibel sein.- Poly-L-Lysin (PLL) auf eine Konzentration von 10 μg/ml in sterilem entionisiertem Wasser resuspendieren. Pipettieren Sie 400 μl des verdünnten PLL in jede Vertiefung einer schwarzwandigen, durchsichtigen 24-Well-Gewebekulturschale mit klarem Boden.
- Beschichten Sie Gewebekulturschalen 2 Stunden lang in einem 37 °C warmen Gewebekultur-Inkubator oder über Nacht in einem 4 °C Kühlschrank.
- PLL mindestens 20 Minuten vor dem Anrichten aus beschichteten Schalen aspirieren. Lassen Sie die restliche PLL aus der Vertiefung trocknen, indem Sie 24 Vertiefungsplatten mit teilweise angelehntem Deckel in eine Gewebekulturhaube legen. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen vollständig trocken sind, bevor Sie isolierte OPCs plattieren. Die Zellen haften nicht an Kunststoff, der flüssiges PLL enthält.
- Prepare N style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>-Acetyl-L-cystein (NAC) Stammlösung (1.000x): 100 mg auflösenN-Acetyl-L-cystein (NAC) in 20 ml von Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM). Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Hydrocortison-Stammlösung (1.000x) herstellen: 1 ml Ethanol zu 1 mg Hydrocortison geben und zum Auflösen schwenken. 19 ml DMEM zugeben, die Lösung mischen, aliquotieren und bei -20 °C lagern. Es hat sich gezeigt, dass die Zugabe von Hydrocortison zu den Basismedien das Überleben von Gliazellen verbessert.
- Bereiten Sie d-Biotin-Stammlösung (5.000x) vor: Lösen Sie 2,5 mg d-Biotin in 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie 1-2 x 5 μl Tropfen 0,1 N NaOH hinzu, um die Auflösung zu unterstützen. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Insulin-Stammlösung (100x) vor: Lösen Sie 25 mg Insulin in 50 ml Wasser in Gewebekulturqualität. 250 μl 1 N HCl zugeben und mischen, bis die Lösung klar ist. Mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren und bis zu 6 Wochen bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie die Sato-Standardlösung vor (100x):
- Progesteron-Stammlösung (25 μg/μl) herstellen: 2,5 mg Progesteron in 100 μl Ethanol auflösen.
- Herstellung einer Natriumselenit-Stammlösung (400 ng/μl): 4 mg Natriumselenit werden in 100 μl 0,1 N NaOH gelöst. 10 ml DMEM zugeben und mischen.
- Zu 100 ml DMEM 1 g humanes Apo-Transferrin, 1 g Rinderserumalbumin und 160 mg Putrescin hinzufügen und mischen, bis es sich vollständig auflöst. 25 μl Progesteron-Stammlösung, 1.000 μl Natriumselenit-Stammlösung zugeben und mischen. Aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- OPC-Basismedium vorbereiten: pro 100 ml DMEM (mit 4,5 g/l D-Glucose, L-Glutamin und 110 mg/l Natriumpyruvat) 100 μl NAC, 100 μl Hydrocortison, 20 μl d-Biotin, 1 ml Insulin, 1 ml Sato-Stamm, 100 μl Spurenelemente B, 2 ml B-27-Supplement (50x) und 1 ml Penicillin/Streptomycin (100x) zugeben. Mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie die Stammlösung mit dem aus dem Thrombozyten-Wachstumsfaktor AA (PDGF-AA) gewonnenen (1.000-fachen) vor: Löse 250 μg in 12,5 ml PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) auf, um eine Lösung von 20 μg/ml herzustellen. Aliquotieren und bei -80 °C lagern.
- OPC-Proliferationsmedien vorbereiten: OPC-Basismedien, ergänzt mit 20 ng/ml PDGF-AA.
- OPC-Differenzierungsmedien herstellen: OPC-Basismedien ergänzt mit 45 nM Trijodthyronin.
- Säulenpuffer vorbereiten: Fügen Sie zu 500 ml PBS 2,5 g BSA und 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu und stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein. Mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
2. Induktion der OPC-Differenzierung und -Fixierung mit 4% Paraformaldehyd
Note: Bei der Prüfung der Wirkung kleiner Moleküle auf die Oligodendrogenese lösen wir Arzneimittel routinemäßig in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf, um 1.000-fache Stammstoffe herzustellen, die dann bei -80 °C gelagert und direkt in SATO-Medien verdünnt werden können, um eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO zu erhalten. Wir haben keine Veränderungen in der OPC-Proliferation oder -Differenzierung unter Verwendung dieser DMSO-Konzentration beobachtet (Daten nicht gezeigt).
- OPC-Basismedien auf 37 °C vorwärmen und Wirkstoffbehandlungsbestände auf Raumtemperatur auftauen. Wenn Sie Behandlungen doppelt durchführen, bereiten Sie ca. 1,25 ml Medium pro Behandlungsgruppe in einem 1,5-ml-Röhrchen vor. Für dreifache Proben sind Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 2 ml zu verwenden, um den Durchhang auszugleichen.
- Bereiten Sie die Behandlungs-Mastermixe für die Replikation von Wells vor, indem Sie die Behandlungsmaterialien direkt in OPC-Basismedien verdünnen. Jeden Mastermix kurz vortexen oder vorsichtig mischen, um eine homogene Verteilung der Behandlung zu gewährleisten.
- Bereiten Sie 45 nM Trijodthyronin vor (T3) als Positivregelung und das entsprechende Fahrzeug als Negativkontrolle. Verdünnen Sie 10 mM T3 1:1.000 in 1 ml OPC-Basismedium einfüllen und anschließend im Behandlungs-Mastermix weiter verdünnen, um die Endkonzentration von DMSO bei Bedarf zu reduzieren.
- Aspirieren Sie das Medium aus den Kulturvertiefungen jeweils eine Behandlungsgruppe, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden. Verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze am Ende der Pasteurpipette aus Glas, um zu vermeiden, dass schwarzes Material von den Seiten der Vertiefung in die Kultur abschabt wird.
- Geben Sie langsam 500 μl Behandlungsmastermix mit einer 1-ml-Pipette entlang der Seite der Vertiefung .
- Inkubieren Sie die Kulturen für den gewünschten Zeitraum und führen Sie alle 2-3 Tage einen vollständigen Medienaustausch mit frischen Behandlungsmedien durch. Wir beobachten routinemäßig eine 30-40% MBP+ Kultur nach 4 Tagen in Differenzierungsmedien.
- Bereiten Sie am Ende der gewünschten Behandlungszeit frisches 4%iges Paraformaldehyd (PFA) zu oder tauen Sie eine gefrorene Brühe auf Raumtemperatur auf. CAUTION: PFA ist extrem giftig und muss in einem Abzug aufbereitet werden.
- Aspirieren Sie das Medium und geben Sie langsam 400 μl PFA an die Seite der Vertiefung, um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie das PFA und fügen Sie langsam 500 μl sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) von Dulbecco hinzu, mit Ca2+ und Mg2+) an die Seite der Vertiefung, um die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie den Waschgang noch zwei weitere Male. Saugen Sie die letzte Wäsche nicht an.
- Wickeln Sie die Platte in Parafilm ein und lagern Sie sie für die spätere Verarbeitung bei 4 °C oder fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort. Die Platten können mehrere Wochen gelagert werden.
3. Immunzytochemie und Quantifizierung des basischen Myelinproteins
Note: Bei der Durchführung von Liquid-Handling-Verfahren auf den 24-Well-Platten wird empfohlen, schnell zu arbeiten, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden. Hier empfiehlt sich der Einsatz eines Mehrkanal-Vakuumsaugers und einer Mehrkanalpipette.
- Bringen Sie die Platte auf Raumtemperatur, saugen Sie die Vertiefungen an und fügen Sie 250 μl D-PBS hinzu (mit Ca2+ und Mg2+) mit 0,1% Triton X-100 und 5% normalem Ziegenserum (NGS). Inkubieren Sie die Platte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Orbitalschütteln.
- Bereiten Sie die primäre Inkubationslösung vor, indem Sie den monoklonalen Anti-MBP-Antikörper der Maus 1:1.000 und den polyklonalen Anti-Aktin-Antikörper der Kaninchen 1:200 in D-PBS verdünnen (mit Ca2+ und Mg2+) mit 5% NGS. Alternativ kann polyklonales Kaninchen-Anti-Olig2 im Verhältnis 1:1.000 zur Oligodendrozyten-spezifischen Normalisierung in gemischten Gliakulturen verwendet werden. Bereiten Sie genügend Primärlösung für 250 μl pro Vertiefung vor.
- Inkubieren Sie Primärantikörper über Nacht bei 4 °C für 16-18 Stunden unter leichtem Orbitalschütteln.
- Aspirieren Sie die primäre Inkubationslösung und waschen Sie die Zellen 3 x 10 min mit 500 μl D-PBS (mit Ca2+ und Mg2+) bei Raumtemperatur mit leichtem Orbitalschütteln.
- Während Sie die Platte waschen, bereiten Sie die sekundäre Inkubationslösung vor, indem Sie die Anti-Maus 680 und Anti-Kaninchen 800 Antikörper 1:500 in D-PBS verdünnen (mit Ca2+ und Mg2+) mit 5% NGS. Minimieren Sie die Exposition gegenüber Umgebungslicht, wenn Sie diese Lösung zubereiten.
- Aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie 250 μl sekundäre Inkubationslösung hinzu. Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Orbitalschütteln.
- Aspirieren Sie die sekundäre Inkubationslösung und waschen Sie die Vertiefungen 3 x 10 min mit 500 μl D-PBS (mit Ca2+ und Mg2+) bei Raumtemperatur mit leichtem Orbitalschütteln.
- Scannen Sie die Platte mit einem Bildgebungssystem, das Fluoreszenzemissionen von 700 nm und 800 nm nachweisen kann. Stellen Sie als Ausgangspunkt den Fokusversatz auf 3 und die Sensitivitäten auf 1,5 für MBP, 5,0 für Aktin und 3,5 für Olig2 ein. Passen Sie die Empfindlichkeitswerte nach Bedarf an, um eine Überbelichtung des Signals zu vermeiden.
- Quantifizieren Sie das Ausmaß der Oligodendrogenese mit halbautomatischen softwarebasierten Methoden.
- Stellen Sie mit der Software den Plattenanalysemodus auf "24 Well" ein und richten Sie Kreise um den äußeren Umfang der gescannten Wells aus. Stellen Sie den Normalisierungskanal auf "800" ein und exportieren Sie die Gesamt- und relativen Fluoreszenzintensitäten für die Kanäle 700 nm (MBP) und 800 nm (Olig2/Aktin).
- Teilen Sie die Intensität bei 700 nm durch die Intensität bei 800 nm, um die normalisierte MBP-Expression in relativen Fluoreszenzeinheiten zu erhalten. Berechnen Sie den Durchschnitt der Replikationsmessungen, und skalieren Sie den Ausdruck nach Bedarf für die Analyse auf die Steuerelemente Tag 0 +PDGF.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PDGF-AA | |||
| Dimethylsulfoxide | |||
| Trijodthyronin | |||
| Clemastinfumarat salt | |||
| Quetiapin Hemifumarate Salz | |||
| N-acetyl cysteine | |||
| Progesterone | 60 ng/ml | ||
| Poly-L-lysine< | |||
| Putrecine | |||
| Natriumselenit | |||
| Hydrocortison | |||
| d-Biotin | |||
| Insulin | |||
| Apo-Transferrin | |||
| Rinderserumalbumin | |||
| Trace Elements B | |||
| B-27 Supplement | |||
| Penicillin/Streptomycin | |||
| DMEM | |||
| 24-well Black Visiplate mit Deckel | |||
| Immunzytochemie und Quantifizierung | |||
| PFA | |||
| Triton X-100 | |||
| Normales Ziegenserum | |||
| mouse monoclonal anti-MBP | |||
| rabbit polyclonal anti-Actin | |||
| Kaninchen polyklonal anti-Olig2 | |||
| goat Anti-Maus 680RD | |||
| goat anti-rabbit 800CW | |||
| Alexa Fluor 594 ziegenanti-maus | |||
| Alexa Fluor 488 ziegenanti-kaninchen | |||
| Prolong Gold antifade with DAPI | |||
| DPBS with Ca2+ und Mg2+ | |||
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System< |
