Visualisierung der Mitochondrien innerhalb der intraepidermalen Nervenfasern

Zusammenfassung

Source: Hamid, H. S., et al. Dreidimensionale Bildgebung und Analyse von Mitochondrien in menschlichen intraepidermalen Nervenfasern. J. Vis. exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Methode zur Visualisierung nervenspezifischer Mitochondrien mittels dreidimensionaler Bildgebung. Es beschreibt den Prozess der Erfassung sequentieller Scans von vormarkierten intraepidermalen Nervenfasern und der Erstellung von 3D-Oberflächenbildern, um Mitochondrien in Bezug auf Nervenstrukturen zu isolieren und darzustellen.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Confocal Imaging

1. Führen Sie konfokale Bildgebung durch:
   1. Sammeln Sie Bilder mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv (1,25 numerische Apertur (N.A.)) an einem inversen Mikroskop.
      1. Erfassen Sie in jeder Fokusebene nacheinander Fluoreszenzsignale:
         Kerne: Anregung λ = 405 nm, spektraler Emissionsfilter λ = 420 - 480 nm
         Nervenfasern: Anregung λ= 488 nm, spektraler Emissionsfilter λ = 505 - 560 nm
         Mitochondrien: Anregung λ = 543 nm, spektraler Emissionsfilter λ= 606 - 670 nm
   2. Geben Sie die folgenden Scanparameter in die Mikroskopsoftware ein: Scanrate von 600 Hz mit 2-Frame-Mittelung und Zoom von 2,2; Auflösung von 12 Bit Intensität (4096 Graustufen).
      1. Stellen Sie die Mikroskopsoftware auf optimierte laterale Auflösung (Scanauflösung = 1.024 x 1.024) und axiale Auflösung/optische Schnittbildung (konfokale Apertur = 1 luftige Einheit (AU) mit einer Z-Schrittgröße von 210 nm) ein.
         HINWEIS: Die resultierende XYZ-Auflösung beträgt 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm bei einer Bildgröße von 176,1 μm x 176,1 μm x 30-50 μm.
   3. Aktivieren Sie einen Live-Scan für das Nervensignal (grüne Fluoreszenz) und passen Sie den Z-Fokus-Regler an, um die obere und untere Fokusebene in der Mikroskopsoftware zu finden und einzustellen, die das Nervensignal innerhalb des Gewebeschnitts umfasst. Der gesamte Z-Bereich beträgt typischerweise 30-50 μm für einen 50-μm-Gewebeschnitt.
   4. Drehen Sie das Scanfeld mit der Mikroskopsoftware während eines Live-Scans so, dass die Epidermis horizontal oder vertikal im Bild positioniert ist.
   5. Scannen Sie jedes Signal separat und passen Sie die Spannung und den Offset des Detektors (Photomultiplier-Röhre, PMT) an, um über- und untersättigte Pixel zu minimieren/zu entfernen.
      HINWEIS: Scanzeiten mit den oben genannten Parametern dauern ca. 20 - 40 Minuten, abhängig von der Anzahl der Z-Scheiben.

2. 3D Visualisierung und Analyse von Mitochondrien in menschlichen intraepidermalen Nervenfasern

1. Isolieren Sie die 3D-Epidermis:<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
2. Duplizieren Sie das Originalbild und verwenden Sie die Projektion mit maximaler Intensität (erweiterte Fokusansicht) des Bildes, um die Epidermis zu identifizieren und zu isolieren.
3. Verwenden Sie ein Region-of-Interest-Tool, um entlang der oberen und unteren Ränder der Epidermis zu zeichnen, um unerwünschte Bereiche wie das Stratum corneum und die Dermis zu entfernen, die keine intraepidermalen Nervenfasern aufweisen. Zuschneiden auf diese Auswahl.

Verwenden Sie die Dekonvolution für die Nerven- und mitochondrialen Fluoreszenzsignale:
NOTE: Dekonvolution hilft, die Integrität der Fluoreszenzsignale wiederherzustellen. Die in diesem Protokoll verwendete Restauration wird als blinde Dekonvolution bezeichnet, da sie die Fluoreszenzsignale in den Bildern verwendet, um zu bestimmen, wie stark sich die Signale von ihrer ursprünglichen Quelle aus ausbreiten (Punktspreizungsfunktion). Der Prozess verbessert die Signalauflösung, indem die Signalspreizung wieder an ihren Ursprungsort zurückversetzt wird.

1. Berechnen Sie eine Punktspreizungsfunktion (PSF) für das grün fluoreszierende Nervensignal (grüne-Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern:
   1. Setzen Sie die berechnete PSF auf konfokal. Stellen Sie den mittleren Brechungsindex auf 1,515 und die numerische Apertur auf 1,25 ein. Stellen Sie die Lochblende des Detektors auf 1 AE ein. Stellen Sie die Wellenlänge der Laseranregung auf 488 nm und die Emissionswellenlänge auf 515 nm ein.
2. Berechnen Sie eine PSF für das rot fluoreszierende mitochondriale Signal (rote Fluoreszenz) mit den folgenden Parametern:
   1. Berechnete PSF auf konfokal setzen. Stellen Sie den mittleren Brechungsindex auf 1,515 und die numerische Apertur auf 1,25 ein. Stellen Sie die Lochblende des Detektors auf 1 AE ein. Stellen Sie die Wellenlänge der Laseranregung auf 543 nm und die Emissionswellenlänge auf 617 nm ein.
3. Optimieren Sie die Fluoreszenzsignale der Nerven und Mitochondrien durch Dekonvolution unter Verwendung der entsprechenden PSFs, die oben aufgeführt sind, und der iterativen Wiederherstellungsfunktion, die auf 100 % Konfidenz und einem Iterationslimit von 10 Zyklen eingestellt ist.

Erstellen Sie nervenspezifische Oberflächen:

1. Verwenden Sie das Werkzeug "Oberfläche erstellen", um eine feste Oberfläche der Nerven aus der entfalteten grün-fluoreszierenden sekundären Markierung des Protein-Genprodukts 9.5 (PGP9.5) identifizierten Nerven zu erstellen.
2. Deaktivieren Sie die Funktion "Glätten" und verwenden Sie die Funktion "Absolute Intensität", um den Schwellenwert für das Nervensignal festzulegen, da es deutlich heller ist als die Hintergrundfluoreszenz.
3. Verwenden Sie die absolute Intensitätsfunktion, um den Schwellenwert für das Nervensignal einzustellen, da es deutlich heller ist als die Hintergrundfluoreszenz. Stellen Sie den Schwellenwert niedrig genug ein, um die Nerven genau zu identifizieren.
4. Filtern Sie kleine, nicht nervenlose Oberflächen basierend auf der Größe heraus.
   HINWEIS: Falls nötig, bearbeiten Sie manuell zusätzliche nicht-nervöse Oberflächen im "Bearbeiten"-Tab, indem Sie die STRG-Taste gedrückt halten, um mehrere Objekte zu markieren, und sie dann mit der Entf-Taste löschen.

Isolierung des nervenspezifischen fluoreszierenden mitochondrialen Signals:

1. Wählen Sie die Registerkarte Bearbeiten der Nervenoberfläche aus, um die Funktion "Maskeneigenschaften" anzuzeigen. Die erzeugte Nervenoberfläche wird verwendet, um Mitochondrien innerhalb dieser Nerven von mitochondrialen Signalen zu isolieren, die mit den Keratinozyten verbunden sind.
2. Da die Schaltfläche "Alle maskieren" ein Fenster "Kanal maskieren" öffnet, wählen Sie das entfaltete rot-fluoreszierende Signal aus dem Pulldown-Menü unter "Kanalauswahl" für das mitochondriale Signal aus.
3. Klicken Sie in das Kästchen, um ein Häkchen bei der Option "Kanal duplizieren, bevor die Maske angewendet wird" zu setzen.
4. Klicken Sie auf das Optionsfeld vor der Option "Konstant innen/außen" der Maskeneinstellungen und klicken Sie in das Kästchen, um ein Häkchen bei der Option "Voxel-Außenfläche setzen auf" zu setzen, und geben Sie 0,00 als Wert ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um den neuen Kanal zu erstellen, der mitochondriale Signale innerhalb der Nervenoberfläche darstellt.

Erstellen Sie Mitochondrien-spezifische Oberflächen:

1. Verwenden Sie das Werkzeug "Oberfläche erstellen", um aus dem neu erstellten fluoreszierenden Kanal der nervenspezifischen mitochondrialen Signale eine feste Oberfläche der Mitochondrien zu erstellen.
2. Deaktivieren Sie die Funktion "Glätten" und wählen Sie die Funktion "Hintergrundsubtraktion", um den Schwellenwert festzulegen. Diese Funktion verwendet einen lokalen Kontrast um das mitochondriale Signal, um Mitochondrien aus dem Hintergrund zu identifizieren.
3. Stellen Sie den Schwellenwert niedrig genug ein, um Mitochondrien genau zu identifizieren. In diesem Beispiel wurde der untere Schwellenwert für eine 16-Bit-Skala (65.536) auf 2.000 festgelegt.
4. Filtern Sie mitochondriale Oberflächen nach Größe. In diesem Beispiel wurde das Voxel-Limit auf 1,0 Voxel festgelegt, was der niedrigstmögliche Grenzwert ist. Falls erforderlich, können Sie Nicht-Mitochondrien-Oberflächen auf der Registerkarte "Bearbeiten" manuell bearbeiten, indem Sie die STRG-Taste gedrückt halten, um mehrere Objekte auszuwählen, und sie dann mit der Entf-Taste löschen.
   HINWEIS: Gelegentlich erstellt die Software Oberflächen, die nicht mit einem unterscheidbaren fluoreszierenden mitochondrialen Signal verbunden sind. In diesen Fällen ist es möglich, sie über die Registerkarte "Bearbeiten" zu entfernen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Volocity x64 Software	Perkin Elmer, Waltham , MA	Version 4.4.0	Volocity Software wird für die Bildverarbeitung verwendet
Imaris x64 3D-Analysesoftware{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Version 7.7.1	Imaris Software wird für die Bildanalyse verwendet