Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Zusammenfassung

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Protokoll

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p style='background-color:#ffffff;line-height:1.380000000000001;margin-bottom:12pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>1. Vorbereitung von Explantaten des Larvengehirns

1. Erstellen Sie eine Bildkammer.
   HINWEIS: Eine stabile Aufzeichnung erfordert, dass die Explantate des Gehirns angebunden werden. Hier wird eine kostengünstige, handgefertigte Bildkammer in der Ca²⁺ Bildgebungssystem.
   1. Kratzen Sie mit einer Pinzette die untere Mitte einer Plastikkulturschale (35 mm x 10 mm), um eine Delle für das ventrale Ganglion des Larvengehirns zu erzeugen, was die Montage erleichtert (Schritt 1.3, Figure 1<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>).
   2. Geben Sie mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf jede Seite der Delle und befestigen Sie einen Wolframstab (0,125 mm Durchmesser, 6 bis 7 mm Länge) an den Kleber.
   3. Machen Sie mit einem kleinen Stück kittähnlichem, wiederverwendbarem Klebstoff eine kreisförmige Wand (10 mm Durchmesser und 3 mm hoch), die die Delle umgibt (Figure 1).
      HINWEIS: Der Raum innerhalb der Wand wird später mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,14 M Natriumchlorid ( NaCl), 0,0027 M Kaliumchlorid (KCl), 0,01 M Phosphation (PO4^3–), pH 7,4 ± 0,05 bei 25 °C).
2. Animal preparation
   NOTE: Für die Kalzium-Bildgebung wird ein Kalziumindikator, GCaMP6s, in dem interessierenden Zelltyp exprimiert, was üblicherweise durch Kombinationen von gewebespezifischem GAL4 und UAS-GCaMP6s. Um sicherzustellen, dass das Signal über den Kandidatenrezeptor vermittelt wird, wird GCaMP6s auch in einer Mutante exprimiert, die im Rezeptor defekt ist.
   1. Wenn experimentelle Vergleiche für verschiedene Genotypen wie Wildtyp und Mutanten erforderlich sind, testen Sie die Larven altersgerecht, um Schwankungen des GCaMP6-Expressionsniveaus und physiologische Unterschiede aufgrund von Entwicklungsstadien zu vermeiden.
   2. Bewahren Sie Elternfliegen (30 Fliegen für jedes Geschlecht) 8 Stunden lang in einem Kulturfläschchen mit Standard-Fliegenfutter auf, um die Eiablage auf der Oberfläche des Futters zu ermöglichen. Kultivieren Sie Larven in Massen unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C und 60-70 % relativer Luftfeuchtigkeit.

3. Dissektion des Larvengehirns
   1. 90-120 h nach der Eiablage (AEL), sammle Larven und wasche sie mindestens 3 Mal mit destilliertem Wasser, um anhaftende Speisereste zu entfernen.
   2. Platzieren Sie eine Larve auf einem quadratischen 1,5-Zoll-Uhrenglas, das mit eiskaltem PBS gefüllt ist.
      HINWEIS: Die nächsten beiden Arbeitsschritte werden in diesem Uhrglas unter dem Präpariermikroskop durchgeführt.
   3. Greifen Sie mit einer Pinzette vorsichtig nach dem mittleren Teil der Larve. Greifen Sie mit einer anderen Pinzette nach den Mundhaken und ziehen Sie vorsichtig an den Mundhaken, um den vorderen Teil der Larve, der das Gehirn enthält, vom Rest des Körpers zu trennen.
      NOTE: Es kann eine chirurgische Schere verwendet werden.
   4. Halten Sie die vordere Spitze mit einer Pinzette fest und drehen Sie die Larve auf links. Entfernen Sie überflüssiges Gewebe, das am Gehirn befestigt ist, wie z. B. Imaginalscheiben, Fettkörper und Ringdrüsen. Trennen Sie vorsichtig das Gehirn von den Mundwerkzeugen.
   5. Tragen Sie 200 μl PBS auf die Innenseite des Rings aus dem kittartigen wiederverwendbaren Klebstoff in der Bildgebungskammer auf. Saugen Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit PBS in eine Pasteur-Pipette und übertragen Sie es dann in die Bildgebungskammer.

4. Das Gehirn in die Bildgebungskammer setzen
   1. Verwenden Sie eine Pinzette, um Muskelfasern zu greifen, die sich aus den ventralen Ganglien erstrecken. Führen Sie das Gehirn vorsichtig in die Delle unter dem Wolframdraht ein.
   2. Ziehen Sie mit einer anderen Pinzette den Wolframdraht leicht nach oben, um das Gehirn in die richtige Position für die Bildgebung zu bringen (Abbildung 1).

2. Erwerb von Ca²⁺ Fluoreszenzbilder

HINWEIS: Gehirnexplantate, die in PBS getaucht sind, werden mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das mit einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse (numerische Apertur, N.A. = 0,5) ausgestattet ist. PBS aktiviert keine Zellen im Gehirn. Werden Bilder auf der Z-Achse benötigt, wird die Objektivlinse mit einem piezoelektrisch aktivierten Linsenbeweger montiert. Ein konfokaler Spinning-Disc-Kopf wird verwendet, um die Zeitauflösung zu verbessern. Für die Bildgebung bei schlechten Lichtverhältnissen ist eine elektronenvermehrende ladungsgekoppelte Gerätekamera am Mikroskop montiert. Die Abbildung der GCaMP6s-Fluoreszenz (Anregung/Emission: 488/509 nm) erfordert einen 488 nm Laser zur Anregung mit einem dichroitischen Strahlteiler und einem Emissionsfilter (z.B., 528 ± 38 nm Bandpassfilter).

1. Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit dem Gehirnexplantat unter dem Mikroskop.
2. Senken Sie die Objektivlinse ab, bis sie den PBS berührt. Positionieren Sie das Gehirn unter Hellfeldbeleuchtung und bringen Sie es in den Fokus. Schalten Sie auf Fluoreszenzlicht um und stellen Sie den Fokus auf die GCaMP6s-markierten Zellen ein.
   NOTE: Das Grundgrün Die Fluoreszenz der GCaMP6s sollte sichtbar sein.
3. Starten Sie die Erfassung bei 250 ms/Frame bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixeln im wassergekühlten Modus mit der entsprechenden Erfassungssoftware (z.B., μManager). Passen Sie die Belichtungszeit an, um Fluoreszenzwerte innerhalb des Dynamikbereichs der CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) zu erhalten, jedoch nicht niedriger als 1000 (beliebige Einheiten), bei 16-Bit-Bildern (Dynamikbereich 0-65.535).
   HINWEIS: Es sollte eine geringe Belichtungszeit verwendet werden, um das Photobleaching der GCaMP6s zu minimieren. Die Belichtungszeit sollte in jedem Experiment optimiert werden, da sie von den Expressionsniveaus von GCaMP6 und der Empfindlichkeit des Nachweissystems abhängt. In unserem Experiment waren es 100 ms mit dilp2>GCaMP6s. Wenn Z-Schnitte für eine bestimmte Bildtiefe erforderlich sind, können je nach Belichtungszeit und Bildintervallen mehrere Z-Schnittbilder aufgenommen werden. Wenn die Kamera über eine ausreichende räumliche Auflösung verfügt, sollte die Binning-Größe (Anzahl der Register auf dem Chip, die in ein digitales Pixel unterteilt werden) erhöht werden, um die Belichtungszeit zu verkürzen.
4. Sobald die Bildgebungsparameter bestimmt sind, nehmen Sie Bilder für 1 Minute vor der Peptidverabreichung auf, um die Signalintensitäten der Basislinie zu ermitteln (F₀).
5. Wenden Sie das Testpeptid an. Lösen Sie dazu 100 μl Peptidlösung in PBS auf und pipettieren Sie sie direkt in das Larvenbad, um eine optimale Konzentration zu erhalten.
   NOTE: Das Peptid Die Lösung sollte langsam injiziert werden (z.B., Durchflussrate 20 μL/s) mit einer Pipette in die Badlösung geben. Ein nicht verwandtes synthetisches Peptid, das in PBS gelöst ist, wird als Negativkontrolle verwendet.
6. Nehmen Sie die GCaMP6s-Emission einige Minuten lang auf.

Ergebnisse

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wolframstab	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000<
Blu Tack	Bostik, Paris, Frankreich	3049100<
Uhrenglas, quadratisch, 1 5/8 Zoll	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900<
CCHa2	SCRUM Inc., Tokio, Japan		Custum-synthetisiertes Peptid<
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japan	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland	Axio Imager A2	Fluoreszenzmikroskop
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland	420957-9900-000<
P-725 PIFOC-Objektivscanner mit großem Verfahrbereich	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland	N/A	Piezoelektrisch aktivierter Linsenbeweger
Konfokale Scannereinheit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokio, Japan	CSU-W1	Drehscheibe konfokaler Kopf
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm laser<
488/568/647 nm Yokogawa dichroitischer Strahlteiler	Semrock, Rochester, NY, USA	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5<
528/38 nm BrightLine Single-Band-Bandpassfilter	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	Emissionsfilter
μManager<	N/A	https://micro-manager.org

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