Live-Bildgebung der Ziliaraktivität von Ependymzellen in einem Schnitt aus dem Gehirn einer Maus

Zusammenfassung

Quelle: Al Omran, A. J., et al. Live-Bildgebung der ependymalen Flimmerhärchen in den lateralen Ventrikeln des Mäusegehirns. J. vis. exp. (2015).

Dieses Video zeigt eine Live-Bildgebungstechnik, bei der die Differenzinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) verwendet wird, um das Schlagen von ependymalen Zilien in sagittalen Gehirnschnitten von Mäusen zu beobachten. Ependymale Zilien treiben Liquor cerebrospinalis (CSF) an, und ihre Aktivität wird in Gehirnschnitten aufgezeichnet, die in einem nährstoffreichen Medium gehalten und in einer klimatisierten Kammer abgebildet werden. Kontrastreiche Videos ermöglichen die Identifizierung funktioneller Zilien und die Quantifizierung ihrer Schlagfrequenz.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Extraktion, Sektion und Gewebevorbereitung des Gehirns

1. Wildtyp-Mausstamm C57BL/6 durch tiefes Einschläfern mit CO₂ 5 min lang eingeschläfert. Sichern Sie den Tod durch Gebärmutterhalsluxation.
2. Reinigen Sie den Mauskopf mit 70% Ethanol.
3. Führen Sie die Kraniektomie mit einer sterilen Schere und Pinzette durch, indem Sie zuerst die Haut abziehen, beginnend mit der Oberseite des Kopfes, um den Schädel freizulegen.
4. Wenn der Schädel freigelegt ist, entfernen Sie den Schädel, indem Sie den Knochen Stück für Stück schälen, beginnend von der hinteren Seite und in Richtung der vorderen Seite. Seien Sie vorsichtig, um die Hirnventrikel nicht zu zerstören.
5. Sammeln Sie das ganze Gehirn.
6. Legen Sie das Gehirn in eine 100-mm-Petrischale, die Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/High-Glucose enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung, die 10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 μg/ml Streptomycin enthält, und auf 37 °C vorgewärmt.
7. Schneiden Sie das Gehirn auf der medianen Sagittalebene mit einer scharfe Klinge und verwenden Sie ein Vibratom, um den ersten 100-200 mm langen Abschnitt aus jeder Hälfte zu erhalten.
8. Spülen Sie das Hirngewebe mit vorgewärmter 37 °C phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS).
9. Legen Sie den Gehirnabschnitt sofort in ein auf 37 °C vorgewärmtes DMEM/High-Glucose-Medium.
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2. Konfiguration und Einrichtung der Live-Bildgebung

1. {{}}Legen Sie die Hirngewebeschnitte in 30-mm-Kulturschalen mit Glasboden, die 1 ml DMEM/High-Glucose-Medium enthalten. Stellen Sie die Umgebung in der geschlossenen Kammer des Mikroskops auf 37 °C, 95 %/5 % O₂/CO₂ (Abbildung 1).
2. Sammeln Sie mit einer 60X-Objektiv-Ölimmersionslinse die Bilder der Ependymzellen/Zilien, indem Sie einen Öltropfen auf die 60X-Objektivlinse geben und auf die Zellen mit regulärem differentiellem Interferenzkontrast (DIC) durchgelassenem Licht fokussieren.
3. Folgen Sie dann der Richtung der DMEM-Blasenbewegung als Leitfaden für die Position der beweglichen Ependymzilien, da die Ziliarschläge eine Art Blasenbewegung in diesem Bereich erzeugen. Wählen Sie mit dem DIC-Filter einen Bereich mit gesunden Zellen mit beweglichen Flimmerhärchen in der Seitenkammer des Gehirns. Sobald die ependymalen Flimmerhärchen gefunden sind, passen Sie das Licht und den Fokus an, um ein zufriedenstellendes Bild zu erhalten.
4. Stellen Sie mit der Metamorph-Bildgebungssoftware die Live-Bildgebungsparameter für einen bestimmten Zweck ein. In der vorliegenden Demonstration erfassen Sie vierundzwanzig-Bit-Bilder mit dem Kamera-Binning auf 1 x 1 in Kombination mit einem 60-fachen Objektiv und einer Belichtungszeit von 5 bis 10 ms.
5. Erfassen Sie die DIC-Bilder, indem Sie die Mikroskopblende auf ein optimales Niveau für eine minimale Belichtungszeit öffnen. Beobachten Sie Live-Bilder, die an die Kamera gestreamt werden, um eine schnelle und sofortige Bildaufnahme ohne Verzögerung zu ermöglichen. Berechnen Sie die Geschwindigkeit der Zilienschlagen, basierend auf der Anforderung der minimalen Belichtungszeiten, um einen ausreichenden Bildkontrast zu erhalten.

Ergebnisse

Materialien