$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Behörde überprüft und genehmigt. Ausschuss für die ethische Überprüfung von Tieren.
1. Vorbereitung von Hirngewebe und SBFSEM-Bildgebung
- Betäuben Sie eine junge (~2 - 4 Monate alte) schwarze C57-Maus (C57BL/6J-Stamm) mit 4 - 5% Isofluran gemäß den institutionellen Richtlinien. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Verlust des Muskeltonus, das Fehlen willkürlicher Bewegungen und Reaktionen auf aversive Reize wie ein Schwanzkneifen überwachen.
- Stecken Sie die Maus auf ein Präpariertablett und machen Sie einen Schnitt in der Haut entlang der ventralen Mittellinie. Machen Sie weitere Schnitte in der Haut, um den Brustkorb der Maus freizulegen. Schneiden Sie das Zwerchfell ein, präparieren Sie vorsichtig die Brusthöhle entlang der Peripherie, um das schlagende Herz freizulegen, und machen Sie dann einen Schnitt am rechten Vorhof.
- Mit einer Schmetterlingskanüle den linken Ventrikel kanülieren. Die Maus wird transkardial mit 10 - 20 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2 perfundiert, bis die Exsanguination durch eine Veränderung der Leberfarbe bestätigt wird.
Note: Eine Veränderung der Leberfarbe wird als Anhaltspunkt verwendet, um das Ausmaß der Blutung zu bestimmen. Vergewissern Sie sich, dass sich die Leberfarbe von rotbraun zu blassrosa ändert. - Perfusionieren Sie die Maus transkardial mit 10 - 20 ml 2 % Glutaraldehyd und 4 % Paraformaldehyd, hergestellt in 0,10 M Cacodylatpuffer (pH 7,2), um das Hirngewebe schnell von innen heraus zu fixieren. Die Fixierung wird durch die Beobachtung der Schwanzversteifung überwacht.
Note: Bereiten Sie 0,10 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) vor, indem Sie 2,14 g Natriumcacodylat in 80 ml Wasser auflösen, Salzsäure hinzufügen, um den pH-Wert einzustellen, und das Volumen mit Wasser auf 100 ml erhöhen. - Nach der Perfusion die Maus enthaupten, das Gehirn sezieren, gefolgt von einer Fixierung in 0,10 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,2) mit 2 % Glutaraldehyd und 4 % Paraformaldehyd für 48 Stunden bei 4 oC.
- Nach 48 Stunden machen Sie 400 μm koronale Schnitte mit einem Vibratom und präparieren Sie dann vorsichtig die interessierende Region im Gehirn (z. B. den Hippocampus) unter dem Präpariermikroskop. Schneiden Sie das Taschentuch vorsichtig ab und machen Sie ein Foto, um die Orientierung zu erhalten.
Note: Die Nachbearbeitungsmethoden der Gewebefärbung in SBFSEM kombinieren eine Vielzahl von Schwermetallfärbemethoden, um die Auflösung zu verbessern. . - Waschen Sie das Glutaraldehyd-fixierte Gewebe 3 Mal à 5 min in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,2).
- Bereiten Sie eine 0,1%ige Gerbsäurelösung vor, indem Sie Gerbsäure in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,2) auflösen. Schwenken, bis es sich aufgelöst hat, und bei Bedarf durch einen 0,45-μm-Filter filtrieren.
- Postfixieren Sie das Gewebe mit cacodylat gepufferter 0,1% Gerbsäure durch Inkubieren in 1 ml Reagenz für 30 - 60 min bei RT.
Note: Die Inkubationszeit hängt von der Gewebegröße ab, aber 30 Minuten sind für die meisten Gewebe am besten. - Waschen Sie das Tuch 3 Mal à 5 min in Cacodylatpuffer (pH 7,2).
- Lösen Sie 0,3 g Kaliumferrocyanid und 0,86 g Natriumcacodylat in 10 ml destilliertem H2O (dH2O). Halten Sie die Kaliumferrocyanidlösung auf Eis. Fügen Sie kurz vor der Verwendung 10 ml 4% Osmiumtetroxid hinzu (OsO4).
- Färben Sie das Gewebe 90 min lang mit 2%iger Osmium-Ferrocyanid-Lösung auf Eis. 3 Mal à 5 min in dH2O.
- Bereiten Sie 1% Thiocarbohydrazid (TCH)-Lösung vor, indem Sie 0,1 g TCH in 10 ml dH2O. Bei 60 °C auflösen, indem alle 10 min geschwenkt wird, bis es vollständig aufgelöst ist. Beachten Sie die Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit TCH, insbesondere darauf, die Verwendung von Metallen, das Erhitzen auf hohe Temperaturen oder das Austrocknen der Lösung zu vermeiden.
- Behandeln Sie die Proben 20 Minuten lang bei RT mit frisch zubereiteten 1% TCH. Waschen Sie sie 3 Mal zu je 5 Minuten in dH2O.
- Verdünnen Sie 4% OsO4 auf 2% mit dH2O, und färben Sie Gewebe mit 2% wässrigem Osmiumtetroxid, indem Sie es 1 Stunde lang inkubieren. Taschentücher 3 mal, je 5 Minuten, mit dH2O.
- Inkubieren Sie die Proben O/N in 1% Uranylacetat in dH2O bei 4 °C.
- Bereiten Sie die Lead-Aspartat-Lösung von Walton vor.
- 0,998 g L-Aspartat in 250 ml auflösen dH2O und fügen Sie dann tropfenweise 10 N Kaliumhydroxid (KOH) hinzu, bis der pH-Wert 5,5 erreicht. Nach der pH-Einstellung 0,066 g Bleinitrat in 10 ml Asparaginsäurefond geben und 30 min auf 60 °C erhitzen.
- Spülen Sie Taschentücher in dH2O und mit Waltons Blei-Aspartat-Färbung 30 min in einem 60 °C Ofen inkubieren. 3 Mal à 5 min waschen, in dH2O.
- Entwässern Sie die Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol unter Verwendung von gekühlten Lösungen von 20 %, 50 %, 75 %, 85 % und 95 % Ethanol für jeweils 5 Minuten, gefolgt von 100 % Ethanol dreimal zu je 10 Minuten.
Note: Verwenden Sie 100% Ethanol aus frisch geöffneten Flaschen, da geöffnetes Ethanol Wasser aus der Luft aufnimmt und die Einbettung fehlschlägt. Bei größeren Gewebeproben sind längere Inkubationen erforderlich. - Waschen Sie die Proben 2 Mal à 15 Minuten in Propylenoxid.
- Stellen Sie Einbettungsharz aus Kunststoff mit 25 ml Harz, 10,5 ml DDSA (Dodecenyl-Bernsteinsäureanhydrid), 15,5 ml NMA (Nadic-Methylanhydrid) und 1 ml DMP-30 (2,4,6-Tris-Dimethylaminomethylphenol) her. Mischen Sie das Harz durch Schütteln. Drehe das Harz und lasse es stehen, bis sich die Blasen auflösen.
Note: Dies ist das Standardrezept mit mittlerer Härte. Andere Arten von Kunststoffen für die Elektronenmikroskopie (EM) können verwendet werden, sollten jedoch im Voraus mit einer nicht unbedingt notwendigen Kontrollprobe getestet werden, da nicht alle Harze für SBFSEM geeignet sind. - Inkubieren Sie das Gewebe O/N in einer 50:50-Mischung aus Einbettungsharz und Propylenoxid in einem Fläschchen, das zunächst verschlossen und nach 2 Stunden wieder entfernt wird, so dass das Propylenoxid über einen Zeitraum von etwa 8 - 10 Stunden verdampft.
- Übertragen Sie das Gewebe für 2 Stunden in 100% frisches Einbettungsharz in saubere Fläschchen.
- Betten Sie die Proben in frisches Einbettharz in flache Formen mit bedruckten Papieretiketten ein und härten Sie sie 48 Stunden lang bei 60 °C in einem Ofen aus. Nach ca. 1 h die Gewebeplatzierung und -ausrichtung erneut kontrollieren und ggf. anpassen.
- Schneiden Sie die Proben auf den interessierenden Bereich zu und montieren Sie sie mit gelierendem Cyanacrylat-Sekundenkleber oder einem leitfähigen Epoxidharz auf einen Aluminiumstift. Beschichten Sie dann die Seiten des Blocks mit kolloidaler Silberpaste, um einen leitenden Weg zum Aluminiumstift zu schaffen.
- Untersuchen Sie Gewebeproben mit einem Rasterelektronenmikroskopsystem, das mit einem Ultramikrotomtisch in der Kammer und einem Rückstreuelektronendetektor mit niedrigem kV ausgestattet ist.
Hinweis: Erwerben Sie eine Geräte- und Standortschulung im Umgang mit der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und werden Sie ein autorisierter Benutzer. Alternativ kann die Zusammenarbeit mit einem Forscher oder einer Core Facility für kleine Projekte möglich sein. Möglicherweise ist auch eine Strahlenschulung erforderlich, da REMs Röntgenstrahlen erzeugen. - Um die Proben abzubilden, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 2,25 kV, bei einer Auflösung von 5 - 10 nm/Pixel, mit Feldgrößen zwischen 80 - 250 μm in x,y (andere Feldgrößen möglich) und Schichtdicke von 50 - 100 nm, mit insgesamt 250 - 600 Schichten in einem Zeitraum von 16 - 20 Stunden.
Note: Einstellungen variieren erheblich zwischen verschiedenen Mikroskopen, einzelnen Proben und der gewünschten Auflösung. Diese Einstellungen sollten Bilder erzeugen, die für viele Proben leicht interpretierbar sind.
2. Analysieren des Bilddatensatzes
Hinweis: Die Image J/Fiji-Software wird zur Analyse des Datensatzes verwendet und stützt sich auf das TrakEM2-Plugin. Die Vorverarbeitungsschritte können mit einer Vielzahl von Softwareprogrammen durchgeführt werden und können je nach Erfahrungsstufe und erhaltenen Stacks umfangreich oder geringfügig sein. Die wichtigsten Transformationen mit der Open-Source-Software (ImageJ ver 1.50b, FIJI download 1. Oktober 2015) werden hier beschrieben.
- Konvertieren Sie Bilder in das 8-Bit-TIFF-Format von den ursprünglichen proprietären 16-Bit-Bildern, indem Sie die Software öffnen und die Menüpunkte Image→Type→8 Bit auswählen.
- Wenn die automatische Kontrast-/Helligkeitskonvertierung während dieses Schritts für Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder erneut und drücken Sie Image→Adjust→Brightness/Contrast. Wählen Sie einen Bereich aus, der für alle Bilder geeignet ist, und drücken Sie auf Anwenden. Führen Sie dann die Konvertierung durch. Note: Bei einigen REM kann dieser Schritt ein Mikroskop erfordern Hersteller-Software.
- Falls erforderlich, aufgrund inakzeptabler Bildbewegungen zwischen den Scheiben (z.B. Drift durch Aufladen), registrieren/ausrichten die Bildstapel (Menüpunkte Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). In den meisten Registrierungssoftwares ist der Modus "Nur-Übersetzung" und nicht der Modus "Starrer Körper" eingestellt.
Note: Viele Ansätze und Software können funktionieren: Das SIFT-Registrierungs-Plug-in funktioniert für viele Anwendungen und es gibt eine virtuelle Stack-Version.- Falls erforderlich, vergrößern Sie die Leinwandgröße vor der Registrierung (Image→Adjust→CanvasSize) oder reduzieren Sie sie auf einen Interessenbereich (Image→Crop).
Note: Es kann zu einer gewissen Drift oder Spreizung kommen, und das Ausprobieren anderer Plugins oder Software kann zu besseren Ergebnissen führen. Manuelle Optionen sind ebenfalls verfügbar (z.B. ImageJ/FIJI, Plugins→Registrierung→ManualLandmarkSelection).
- Falls gewünscht, skalieren Sie Bilder auf eine kleinere, handlichere Größe (z.B. 25%) mit ImageJ (Image→Scale).