Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen der Maus durch Fluoreszenzverfolgung

Zusammenfassung

Source: Laboissonniere, et. al. Einzelzell-RNA-Seq definierter Untergruppen von retinalen Ganglienzellen. J. Vis. exp. (2017).

Dieses Video zeigt eine Fluoreszenzverfolgungstechnik zur Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen (RGC) in einer transgenen Mausnetzhaut. Der Prozess umfasst die Sicherung der isolierten Netzhaut in einer Aufnahmekammer, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit durch sauerstoffhaltige Perfusion und das Targeting fluoreszenzmarkierter RGCs mit einer Pipette mit einem Tracer. Durch die Analyse der dendritischen Morphologie und Stratifizierung ermöglicht die Methode die Klassifizierung unterschiedlicher RGC-Subtypen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Prüfung überprüft und genehmigt.

1. Präparation von Netzhautgewebe (2 h)

HINWEIS: Alle Eingriffe in diesem Abschnitt sollten unter schwacher roter Beleuchtung durchgeführt werden

1. Tiere mindestens 1 h vor der Sektion dunkeladaptieren. Führen Sie alle Vorgänge bei schwacher roter Beleuchtung durch.
2. Euthanasiere die Tiere durch CO₂ und enukleiere die Augäpfel in eine Petrischale mit zuvor sauerstoffreicher extrazellulärer Lösung.
3. Stechen Sie mit einer Nadel in die Hornhaut und schneiden Sie sie mit einer Augenschere an der Grenze von Hornhaut und Sklera ab.
4. Entfernen Sie die Linse mit der Pinzette #5. Machen Sie mit der Zange vorsichtig einen Riss in die Sklera und durchtrennen Sie den Sehnerv an der Stelle, an der sich Netzhaut und Sklera treffen. Entfernen Sie die Sklera vorsichtig von der Netzhaut.
5. Entfernen Sie den transparenten Glaskörper mit einer Pinzette #5; Nach der Entnahme erscheint der Glaskörper als gallertartige Substanz, die an der Pinzette haftet. Schneiden Sie die Netzhaut in zwei Hälften (so dass 4 Stück/Tier übrig sind) und lagern Sie sie bis zur Verwendung in sauerstoffreicher extrazellulärer Lösung bei RT.
6. Wenn Sie bereit sind, das Gewebe in die Aufnahmekammer zu montieren, legen Sie ein Stück Netzhaut zur Inkubation in eine Enzymlösung ein, die in 500 μl sauerstoffreicher extrazellulärer Lösung verdünnt ist. In einer Petrischale 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker inkubieren.
   1. Waschen Sie das Stück Netzhaut in sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung und legen Sie das Gewebe in eine Aufzeichnungskammer mit Glasboden. Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff, bei der die Spitze abgeschnitten ist, damit die Netzhaut übertragen werden kann, ohne das Gewebe zu beschädigen.
7. Glätten Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette, wobei die Photorezeptorschicht nach unten zeigt. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette. Verankern Sie das Gewebe mit einem Platinring mit Nylonnetz.
   HINWEIS: Diese Methode könnte auch verwendet werden, um das Gewebe für die Isolierung von RNA aus markierten Amakrin- und Bipolarzellen vorzubereiten.
8. Füllen Sie die Kammer mit sauerstoffreicher extrazellulärer Lösung und montieren Sie sie auf einen Mikroskoptisch. Perfundierte Gewebe mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung bei 2-4 ml/min.

{{}}

3. Visualisierung und Targeting von GFP+ retinalen Ganglienzellen (10 min)

HINWEIS: Alle Eingriffe in diesem Abschnitt sollten unter schwacher roter Beleuchtung durchgeführt werden

1. Bevor Sie beginnen, Mikropipetten aus Glas (Außendurchmesser [AD]: 1,2 mm, Innendurchmesser [ID]: 0,69 mm) für elektrophysiologische Ableitungen mit einem Mikropipettenabzieher. Verwenden Sie für die Elektroden das folgende Protokoll (bitte beachten Sie, dass die Parameter entsprechend angepasst werden sollten, um den gewünschten Widerstand zu erreichen, und je nach Abzieher und Glas variieren): Hitze: Rampe +10; Ziehen: 0; Menge: 23; Verzögerung: 1; Druck: 500; Programmschleife: 5 mal. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen einen Durchmesser von ~1 μm haben, mit Widerständen von 2-4 MΩ für große Zellen und von 5-7 MΩ für kleinere Zellen.
2. Betrachten Sie die Ganglienzellschicht mit einer Infrarot-Differentialinterferenzkontrastoptik (IR-DIC) (Abbildung 1A). Identifizieren Sie grün fluoreszierendes Protein (GFP)+ retinale Ganglienzellen (RGCs) mittels Epifluoreszenz (~480 nm) (Abbildung 1B).
3. Lokalisieren Sie die mit intrazellulärer Lösung gefüllte Pipette in DIC. Wenden Sie einen leichten Überdruck und Nullspannungs-Offsets an den Verstärker an.
4. Drücken Sie die Glasmikropipette gegen eine GFP+-Zelle und üben Sie Unterdruck aus, um eine GΩ-Dichtung zwischen der Pipette und der Zellmembran zu bilden. Wenden Sie die Befehlsschritte der Prüfspannung ( an, z. B. 5 mV), um den Dichtungswiderstand zu überwachen. Nachdem Sie eine stabile Versiegelung gebildet haben, brechen Sie die Membran auf, indem Sie kurze Unterdruckimpulse anwenden, um Zugang zur gesamten Zelle zu erhalten.
5. Warten Sie 1-2 Minuten, bis sich die Dendriten der Zelle mit fluoreszierendem Tracer gefüllt haben.
   HINWEIS: Die Zelle kann morphologisch typisiert werden, indem die Morphologie in Epifluoreszenz untersucht wird (Abbildung 1C). Im Falle von Melanopsin-exprimierenden RGCs wird die dendritische Schichtung in der inneren plexiformen Schicht visualisiert, indem die mit fluoreszierendem Tracer gefüllten Dendriten unter epifluoreszierender Beleuchtung untersucht und bestimmt wird, ob sie weit vom Soma entfernt in der OFF-Sublamina (M1 ipRGCs), in der Nähe der Ganglienzellschicht in der ON-Sublamina (M2 & M4 ipRGCs) oder beides (M3 ipRGCs) schichten. Diese Beobachtung, kombiniert mit der Soma-Größe (M4s haben im Vergleich zu allen anderen ipRGC-Subtypen deutlich große Somas), ermöglicht die Identifizierung des Zelltyps. Somit ermöglicht diese Technik die Identifizierung des Zelltyps in vitro vor der RNA-Isolierung. Diese Methode könnte für andere Zelltyp-Identifizierungsprotokolle modifiziert werden, die entweder die dendritische Morphologie oder die Zellphysiologie betreffen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Identifizierung ...

Materialien