Dieses Video zeigt die Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethode zur Analyse Neurofilamenttransport in myelinisierten Axonen peripherer Nerven. Durch die Verfolgung von photoaktivierten grünen Fluorophor-markierten Neurofilamenten ermöglicht die Technik Einblicke in den axonalen Transport bei neurodegenerativen Erkrankungen.
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Methodenartikel
Fluoreszenz-Photoaktivierungsbildgebung des Neurofilamenttransports in myelinisierten Mausaxonen
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29. Mai 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
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p style='line-height:1.380000000000001;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.1. Zubereitung von Nervensalzlösung
- Stellen Sie 100 mL Breuer-Kochsalzlösung her: 98 mM Natriumchlorid (NaCl), 1 mM Kaliumchlorid (KCl), 2 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 1 mM Magnesiumsulfat (MgSO4), 1,5 mM Calciumchlorid (CaCl2), 5,6% D-Glukose, 23,8 mM Natriumbicarbonat (NaHCO3) in doppelt destilliertem Wasser.
- Blasen Sie 95 % Sauerstoff/5 % Kohlendioxid (Carbogen) vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang durch die Kochsalzlösung. Übrig gebliebene Kochsalzlösung kann innerhalb einer Woche wiederverwendet werden; Es muss jedoch vor jedem Gebrauch mit Sauerstoff angereichert werden.
- Gießen Sie sauerstoffhaltige Kochsalzlösung in eine 60-ml-Spritze und stellen Sie sicher, dass nur wenig Luft in der Spritze verbleibt.
2. Anfänglicher Aufbau der Nervendurchblutungskammer
- Verbinden Sie die Spritze und den Schlauch wie in Abbildung 1A und legt das Abflussrohr in einen Abfallkolben.
- Setzen Sie die äußere Dichtung in das Gehäuse der Perfusionskammer ein und stellen Sie sicher, dass die Einlass- und Auslasspfosten mit den Löchern in der Dichtung ausgerichtet sind.
- Legen Sie die innere Dichtung (Silikon, 100 μm dick) auf ein kreisförmiges Deckglas #1,5 (40 mm Durchmesser) und glätten Sie vorsichtig alle Falten in der Dichtung, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Um die spätere Montage zu erleichtern, legen Sie das Deckglas und die Dichtung mit der Dichtung nach oben auf ein Papiertuch oder ein Arbeitstuch.
3. Dissektion und Vorbereitung des Schienbeinnervs der Maus
- Opfern Sie das Tier durch Einatmen von Kohlendioxid oder eine andere institutionell anerkannte Methode. Starten Sie einen Timer, wenn das Tier aufhört zu bewegen/zu atmen, da die Experimente nur innerhalb von 3 Stunden nach der Tötung durchgeführt werden dürfen.
- Besprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol und entfernen Sie mit einem Elektrorasierer so viel wie möglich von den Beinen und dem Rücken des Tieres.
- Machen Sie mit einer großen Präparierschere einen dorsalen Schnitt in der Haut in der Nähe der Mitte der Wirbelsäule und setzen Sie den Schnitt um die ventrale Seite des Tieres fort. Ausgehend von diesem Schnitt reflektieren Sie langsam die Haut von den Beinen, indem Sie sie sanft vom Muskel wegziehen und die Faszie durchtrennen.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Seziertablett und stecken Sie alle vier Pfoten fest. Optional können Sie den Schwanz feststecken, um die Bewegung weiter zu reduzieren.
- Machen Sie mit einer Mikrodissektionsschere einen Schnitt in die Oberschenkelmuskulatur auf halbem Weg zwischen Schwanz und Knie, um den Ischiasnerv freizulegen. Achten Sie darauf, dass der Nerv, der durch den Muskel sichtbar ist, nicht durchtrennt wird.
- Verlängern Sie den Schnitt dorsal und ventral, um den Muskel zu entfernen. Entfernen Sie auf ähnliche Weise die Muskeln der Wade und halten Sie die Schnitte flach und kurz, um Nervenschäden zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Muskeln, bis der Nervus tibialis vollständig freigelegt ist, von dem Punkt, an dem er sich vom Ischiasnerv (am Knie) zur Ferse verzweigt (Abbildung 2A).
HINWEIS: Vermeiden Sie bei allen Schritten, einschließlich und nach der Dissektion des Nervus tibialis, unnötige Exposition gegenüber Umgebungslicht, um eine mögliche zufällige Aktivierung des photoaktivierbaren grün fluoreszierenden Proteins (paGFP) im Nerv zu minimieren. - Fassen Sie den Nervus tibialis am proximalen Ende der Wirbelsäule mit einer Pinzette und schneiden Sie den Nerv mit einer Mikrodissektionsschere durch. Achten Sie darauf, den Nerv nicht zu belasten, heben Sie ihn vom Muskel weg und durchtrennen Sie alle Ansätze.
- Schneiden Sie das spine-distale Ende des Nervus tibialis ab und geben Sie es in eine kleine Petrischale mit sauerstoffreicher Kochsalzlösung bei Raumtemperatur. Achten Sie ab diesem Zeitpunkt des Eingriffs immer darauf, die proximalen und distalen Enden des Nervs im Auge zu behalten.
HINWEIS: Eine Möglichkeit, dies zu tun, besteht darin, das distale Ende des Nervs mit einem abgewinkelten Schnitt zu markieren, so dass die Verjüngung sichtbar ist. - Beginnen Sie mit dem proximalen Ende des Nervs und fassen Sie die freiliegenden Axonenden vorsichtig mit einer Pinzette mit sehr feiner Spitze.
- Fassen Sie mit einer zweiten Pinzette die Nervenscheide proximal und ziehen Sie sie langsam in Richtung des distalen Endes des Nervs. Die Nervenscheide gleitet mit minimalem Widerstand entlang der Axone. Stellen Sie sicher, dass der Nerv während dieses Prozesses nicht übermäßig gespannt wird.
4. Endgültige Montage der Nervendurchblutungskammer
- Fassen Sie das proximale Ende des Nervs, entfernen Sie es aus der Kochsalzlösung und legen Sie es langsam auf das Deckglas der Perfusionskammer innerhalb der rechteckigen Öffnung der inneren Dichtung, wobei Sie den Nerv beim Ablegen sanft anspannen, so dass er gerade liegt.
- Platzieren Sie den Mikroaquäduktschieber über dem Nerv, wobei die gerillte Seite zum Nerv zeigt und die Strömungsrichtung parallel zum Nerv verläuft. Drehen Sie das Deckglas und die Mikroaquäduktbaugruppe um und platzieren Sie sie in das Gehäuse der Perfusionskammer, wobei der Mikroaquäduktschieber an der äußeren Dichtung angebracht ist. Der Nerv und die umgebende innere Dichtung werden nun zwischen dem Deckglas und dem Mikroaquäduktschieber eingeklemmt, die durch die Dichtung getrennt sind, wobei das Deckglas nach oben zeigt (Abbildung 1B).
- Sichern Sie die Perfusionskammer, indem Sie sie in das Metallgehäuse einsetzen und den Sicherungsring drehen. Stellen Sie sicher, dass sich das Kunststoffgehäuse vollständig unter allen Metallklammern befindet, und ziehen Sie es gut fest, um ein Austreten von Kochsalzlösung zu verhindern. Ein zu festes Anziehen kann zu Rissen des Mikroaquädukts oder des Deckglases führen. Drehen Sie die Kammer um, so dass das Deckglas nach unten zeigt.
- Drücken Sie langsam den Kolben der Kochsalzlösungsspritze, um die Perfusionskammer zu füllen. Halten Sie den Einlass- und Auslassschlauch, den Auslasskolben und die Spritze während der Einrichtung und Bildgebung immer über der Kammer selbst hoch. Dadurch wird ein Absaugen vermieden, das Blasen einbringen oder aufgrund von Unterdruck in der Kammer zu Fokusinstabilität führen kann.
- Übertragen Sie die Perfusionsanordnung auf einen inversen Mikroskoptisch und montieren Sie die Kochsalzspritze in die Spritzenpumpe. Starten Sie den Motor mit einer geeigneten Drehzahl für eine Durchflussrate von 0,25 mL/min. Schließen Sie dann die auf 37 °C eingestellte Inline-Lösungsheizung an und schalten Sie sie ein.
- Schließen Sie die Objektivheizung an und stellen Sie sie auf 37 °C ein, tragen Sie Öl auf das Objektiv auf und setzen Sie die Perfusionskammer in die Tischhalterung ein.
- Tragen Sie Öl auf das Heizkissen der Kammer auf und befestigen Sie es an der Perfusionskammer. Schließen Sie die Kammerheizung an und schalten Sie sie ein. auf 37 °C eingestellt.
HINWEIS: Temperaturänderungen können dazu führen, dass sich durch Ausgasen der Lösung Blasen in der Perfusionskammer bilden. Wenn sich Blasen bilden, erhöhen Sie die Durchflussrate der Lösung kurzzeitig um das 5-10-fache, bis die Blasen die Kammer reinigen. - Verriegeln Sie die Perfusionskammer mit dem Tischadapter und bringen Sie das Objektivöl mit dem Deckglas an der Unterseite der Kammer in Kontakt.
HINWEIS: Die hier verwendete Bioptechs-Kammer mit ASI-Tischadapter ist für eine inverse Mikroskopkonfiguration ausgelegt.
5. Fluoreszenzaktivierung und Bildaufnahme
- Fokussieren Sie sich mit Hellfeldbeleuchtung auf die Axonschicht auf der Unterseite des Nervs, die der Deckglasoberfläche am nächsten liegt (Figure 2B). Myelinisierte Axone (typischerweise 1 - 6 μm Durchmesser bei adulten Mäusen) können durch das Vorhandensein einer Myelinscheide identifiziert werden, die unter Hellfeld-Durchlichtbeleuchtung ohne Kontrastverstärkung sichtbar ist. Schmidt-Lanterman-Spalten und -Knoten von Ranvier sind ebenfalls gut zu erkennen. Unmyelinisierte Axone sind schlanker (typischerweise <1 μm Durchmesser) und liegen im Allgemeinen in Bündeln (Remak-Bündeln) vor, wo sie im Allgemeinen zu eng beieinander liegen, um voneinander aufgelöst zu werden.
- Falls am Mikroskop verfügbar, aktivieren Sie das Autofokus-System, um den Fokus während der Zeitrafferaufnahme beizubehalten.
- Erfassen Sie ein Hellfeld-Referenzbild. Notieren Sie die Ausrichtung des Nervs (spine-proximale und distale Enden) in Bezug auf Bilder.
- Erfassen Sie ein konfokales Bild mit einem 488-nm-Laser und einem für paGFP geeigneten Emissionsfilter (z. B. 525/50 nm), um die Autofluoreszenz vor dem Bleichen aufzuzeichnen. Halten Sie die Laserleistung niedrig, um Photobleaching zu minimieren, und passen Sie die Belichtungszeit entsprechend an, um das schwache Signal zu erkennen. Als Beispiel wurden repräsentative Daten bei 5% Laserleistung und 4 s Belichtung aufgenommen. Notieren Sie die Aufnahmeeinstellungen, um sie in allen zukünftigen Experimenten zu verwenden.
HINWEIS: Nach der Photoaktivierung erzeugen die idealen Bildgebungseinstellungen ein Signal-Rausch-Verhältnis von > 8 und ein Photobleaching von weniger als 25 % des Originalsignals im Verlauf von 20 Bildern. Die Axone können auch durch Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, wie wir es ursprünglich getan haben, aber die Bildqualität wird aufgrund mangelnder Konfokalität schlechter sein. - Stellen Sie die Laserleistung auf ca. das 5-fache der normalen Bildleistung ein und nehmen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von 3-4 Minuten auf. Obwohl dieser Schritt nicht unbedingt erforderlich ist, wird er empfohlen, um Autofluoreszenz und andere Quellen unerwünschter Fluoreszenz zu bleichen, um das Hintergrundsignal zu reduzieren und somit das Signal-Rausch-Verhältnis der photoaktivierten Fluoreszenz zu maximieren.
- Nehmen Sie ein Bild mit den Einstellungen auf, die Sie in Schritt 5.4 verwendet haben, um die Autofluoreszenz vor der Aktivierung nach diesem Bleichschritt aufzuzeichnen.
- Zeichnen Sie auf dem Hellfeldbild eine Linie parallel zu den Axonen mit einer Länge, die der gewünschten Größe des Aktivierungsfensters entspricht. Die Länge dieses Fensters variiert je nach experimentellem Ziel und Parametern, aber typische Längen sind 5 μm für das Puls-Escape-Paradigma und 40 μm für das Puls-Spread-Paradigma.
- Zeichnen Sie mit dieser Linie als Leitfaden einen rechteckigen Interessenbereich (ROI) quer über das Sichtfeld, senkrecht zu den Axonen. Die Region muss alle Axone umfassen, die photoaktiviert werden sollen.
- Bestimmen Sie die optimalen Einstellungen für die Photoaktivierung mit 405 nm Beleuchtung.
HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt und die Teilschritte nur vor der ersten experimentellen Aktivierung aus. Im Verlauf eines Experiments müssen die gleichen Photoaktivierungseinstellungen verwendet werden.- Aktivieren Sie einen Bereich von Interesse wiederholt mit der 405-nm-Laserlinie, geringer Laserleistung (z. B. 5 %) und Pixelverweilzeit (z. B. 40 μs) und einem Impuls, wobei nach jeder Aktivierung ein Bild des aktivierten grün fluoreszierenden Proteins oder der GFP-Fluoreszenz aufgenommen wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Fluoreszenz nicht mehr zunimmt, und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenz in einem interessierenden Bereich für jedes Bild.
- Plotten Sie die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten im Vergleich zur Pulszahl. Wählen Sie die Anzahl der Impulse, nach der die Fluoreszenz nicht mehr zunimmt, als optimale Anzahl der Impulse für die Aktivierung.
- Aktivieren Sie die paGFP-Fluoreszenz in dem in Schritt 5.8 gezeichneten Bereich durch gemusterte Anregung mit 405 nm Licht. Stellen Sie sicher, dass ein Bild kurz vor und kurz nach der Aktivierung erfasst wird.
HINWEIS: Die ideale paGFP-Aktivierung erzeugt einen klar definierten Fluoreszenzbereich mit scharfen Grenzen innerhalb des interessierenden Bereichs oder ROI. - Starten Sie einen 1-Minuten-Timer, wenn die Aktivierung abgeschlossen ist. Beginnen Sie nach Ablauf von 1 Minute mit der Aufnahme einer Zeitrafferserie.
HINWEIS: Die Verzögerung von 1 Minute ist notwendig, um den Anstieg der Fluoreszenz zu berücksichtigen, der nach der Photoaktivierung von paGFP beobachtet wird. Für das Puls-Spread-Verfahren ist eine Erfassungsperiode von 5-10 Minuten mit 30-sekündigen Zeitrafferintervallen ausreichend für die Messung der anfänglichen Steigungen im Mittel- und Flankenfenster zur Messung von Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit. Für das Puls-Escape-Verfahren ermöglicht eine Erfassungszeit von 30-150 Minuten mit 5- oder 10-minütigen Zeitrafferintervallen die Analyse des Langzeit-Pausierverhaltens der Filamente. - Speichern Sie alle erfassten Bilder sowie den ROI, der für die Fluoreszenzaktivierung verwendet wurde.
- Bewegen Sie sich in eine neue Region des Nervs und wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.11. Wenn sich die neue Region entlang desselben Axons befindet, muss sie mindestens 500 μm von der zuvor aktivierten Region entfernt sein, um den Nachweis von fluoreszierenden Neurofilamenten zu vermeiden, die sich aus der anderen aktivierten Region bewegt haben. Die Erfassung des endgültigen Zeitraffers muss vor Ablauf des 3-Stunden-Fensters abgeschlossen sein.
HINWEIS: Es ist möglich, dass das Präparat länger als 3 Stunden haltbar ist, aber das haben wir nicht bestätigt. Bei fachkundiger Präparation und Vorbereitung können innerhalb dieses 3-Stunden-Zeitfensters zwischen fünf und acht 10-minütige Zeitraffer-Bildsätze aufgenommen werden. - Nachdem die endgültige Zeitraffer-Bildserie aufgenommen wurde, stoppen Sie den Fluss von Kochsalzlösung, trennen Sie die Lösungs- und Kammerheizungen und entfernen Sie das Perfusionsgerät vom Mikroskoptisch.
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Ergebnisse
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 14 x 22 Rechteckdichtung 0,1mm | |||
| 2-deoxy-D-glucose | D6134< | ||
| 30mm Runde Dichtung mit Löchern | |||
| 35 x 10mm dish | 153066 | ||
| 40mm runde Deckgläser | 40-1313-0319 | ||
| 60mL Spritze - Luer-Lock-Spitze | |||
| Andor Revolution WD konfokales Spinning-Disk-System | Ausgestattet mit den Systemen Perfect Focus und FRAPPA | ||
| Calciumchlorid | Fisher | ||
| Coverslips | |||
| D-(+)-Glukoselösung | Sigma | ||
| Pins sezieren | |||
| Dissektionszange | |||
| Dissektionsmikroskop | Zeiss | ||
| Sezierpfanne mit Wachs | |||
| Dissektionschere | |||
| FCS2 Perfusionskammer | Bioptechs | ||
| Fluorescein-Natrium | |||
| Inline-Lösungsheizung | |||
| Laminektomie-Pinzette | |||
| Magnesiumsulfat | Sigma-Aldrich | ||
| Mikroaquädukt-Folie | |||
| Objektträger | |||
| Mikroskoptisch insert | I-3017< | ||
| Objektives Heizsystem | Oko Touch mit objektivem Kragen | ||
| Objektives Öl - type A | Nikon | ||
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA Ziel | |||
| Kaliumchlorid | |||
| Kaliumphosphat | |||
| Natriumbicarbonat | |||
| Natriumchlorid | |||
| Spritzenpumpe | |||
| Schlauchadapter - weiblich | |||
| Schlauchadapter - männlich | |||
| Tygon-Schlauch | 1/16" ID, 1/32" Wandstärke | ||
| Vannas Federschere | Fine Science Tools |
