Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Abbildung der neuronalen Morphologie in einem Maus-Welpen

Zusammenfassung

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo<span style='font-family:"Arial",sans-serif;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'> Zwei-Photonen-Bildgebung von kortikalen Neuronen bei neugeborenen Mäusen. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Zwei-Photonen-Mikroskopie, die verwendet wird, um Neuronen im Gehirn eines anästhesierten transgenen Mauswelpen abzubilden. Der Zwei-Photonen-Laser ermöglicht eine tiefere Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung und minimaler Lichtstreuung und ermöglicht die detaillierte Erfassung der neuronalen Morphologie, einschließlich dendritischer Projektionen.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierarzt JoVE überprüft <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>

1. Vorbereitung des Schädelfensters

1. Betäuben Sie den Welpen mit Isofluran (1,0% - 2,0%) und überprüfen Sie den Anästhesiegrad durch einen Schwanz-Pinch-Test.
2. Öffnen Sie den Schädel vorsichtig mit einer sterilisierten Rasierklinge und lassen Sie die Dura intakt (1 mm Durchmesser) (Abbildung 1C). Verwenden Sie einen Gelatineschwamm (mit einer sterilisierten Schere in kleine Stücke geschnitten, ca. < 2 mm3, und tragen Sie sie mit einer Pinzette auf), der in Cortex-Puffer (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L Glukose, 10 mmol/L HEPES (4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure), 2 mmol/L CaCl₂ und 2 mmol/L MgSO₄; pH 7,4; 300 mOsm/L; Raumtemperatur), um das Ausbluten zu stoppen. Tragen Sie beim Öffnen des Schädels einen Cortex-Puffer auf, um die Gehirnoberfläche feucht zu halten.
3. Entfernen Sie mit einem Gelatineschwamm jeglichen Puffer und Blut von der duralen Oberfläche. Tragen Sie mit gelben Spitzen eine dünne Schicht 1,0 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf (gelöst in Cortex-Puffer). Halten Sie die Temperatur der Agaroselösung mit einer Heizblockmaschine bis zum Auftragen auf 42 °C.
   HINWEIS: Die Entleerung des Puffers und des Blutes muss von der Seite des Kraniotomie aus erfolgen, wobei darauf zu achten ist, dass der trockene Gelatineschwamm nicht mit der Dura in Berührung kommt. Andernfalls kann die Dura beschädigt werden.
4. Tragen Sie ein rundes Glasdeckglas (Nr. 1, 3 mm Durchmesser) auf die Agarose-Gelschicht auf. Entfernen Sie alle Blasen zwischen dem Deckglas und der Agarose-Gel-Schicht, indem Sie einen Überschuss Agarose-Gel dazwischen gießen. Entfernen Sie das überschüssige Gel, das unter dem Deckglas hervorragt, mit einer Pinzette (Figure 1D und1E).
5. Befestigen Sie das Deckglas mit Zahnzement (Figure 1F).
6. Mischen Sie das Zementpulver und die Zementflüssigkeit. Tragen Sie die Mischung mit gelben Spitzen auf, bevor sie fest wird. Tragen Sie keinen Zahnzement auf die Dura auf, da dies das Gehirn schädigen kann.
7. Befestigen Sie einen sterilen Titanstab (Sonderanfertigung, ca. 30 mg, siehe Abbildung 1G) auf dem Schädelknochen mit Zahnzement. Richten Sie die Titanstange und das Deckglas (auf der Oberfläche der Dura) parallel aus, um Bilder einfach aufzunehmen.
8. Decken Sie den freiliegenden Schädel mit Zahnzement ab (Figure 1H<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>).
9. Erholen Sie den Welpen aus der Narkose. Auf einer Heizung (37 °C) aufbewahren, bis sich der Zahnzement verfestigt hat (1 h).

2. Zwei-Photonen-Imaging

1. Stellen Sie die Wellenlänge des Zwei-Photonen-Lasers ein. Für die RFP-Anregung (Rot fluoreszierendes Protein) verwenden Sie 1.000 nm (450 mW/mm2 in 400 μm Tiefe).
   NOTE: Die Laserleistung sollte verkleinert werden, wenn die Z-Position nach oben verschoben wird.
2. Wischen Sie die Oberfläche des Deckglases mit 70 % Ethanol ab.
3. Betäuben Sie den Welpen mit Isofluran (1,5 % - 2,0 %) und überprüfen Sie das Narkoseniveau mit einem Schwanzklemmtest.
4. Befestigen Sie den Welpen mit einem Titanstab am Kopf des Welpen an der Titanplatte auf dem Bildgebungstisch (Abbildung 2A und 2B). Stellen Sie den Kopf so ein, dass das Deckglas parallel zur Objektivlinse ist, indem Sie den Goniometertisch verwenden (Figure 2B). Halten Sie die Körpertemperatur des Welpen mit einem Heizkissen (37 °C) aufrecht.
5. Stellen Sie die Isoflurankonzentration auf 0,7 % - 1,0 % ein.
   NOTE: Eine sehr hohe Isoflurankonzentration kann während der Bildgebung zum Unfalltod des Welpen führen.
6. Platzieren Sie den Bildgebungstisch unter der Objektivlinse (20X, NA 1.0) des Zwei-Photonen-Mikroskops (Abbildung 2B und 2C).
7. Tragen Sie einen Tropfen Wasser auf das Deckglas auf. Verwenden Sie Epi-Fluoreszenz, um die mit fluoreszierenden Proteinen markierten Neuronen in dem Bereich zu lokalisieren, in dem die Dura freigelegt wurde.
8. Erfassen Sie Z-Stack-Bilder in Intervallen von 1,4 μm. Für die Bildgebung von Neuronen auf Schicht 4 setzen Sie die Z-Breite auf 150 - 300 μm, um die gesamte dendritische Morphologie abzubilden (Figure 2D und 2E). Verwenden Sie langsames Scannen und Mittelwertbildung, um klare Bilder zu erhalten, die die neuronale Morphologie zeigen (normalerweise dauert es > 20 Minuten, um die gesamte dendritische Morphologie zu erfassen).
   HINWEIS: Für die Bildgebung werden die folgenden Parameter empfohlen. Anregungswellenlänge: 1.000 nm, Scanner: Galvanometer-Typ, dichroitischer Spiegel: 690 nm, Emissionsfilter: 575 - 620 nm Bandpass, Detektor: GaAsP-Typ, Verstärkungseinstellung > 100, Bildgröße > 512 x 512 μm, Sichtfeld > 600 x 600 μm, Pixelauflösung < 1,2 μm.

Ergebnisse

Abbildung 1: Chirurgie, Schädelfenster Vorbereitung und Befestigung der Titanstange. (A) Dieses Bild zeigt d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pK031. TRE-Cre	Autoren	-	Verfügbar ab RIKEN BRC und Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Autoren	-	Verfügbar ab RIKEN BRC und Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Autoren	-	Verfügbar ab authors
Isofluran	Wako	099-06571
410 Anästhesieeinheit (Isoflurangasmaschine)	Univentor	8323101
Vetbond (Gewebekleber)	3M	084-1469SB
MμltiFlex Round (Tipp zum Laden)	Sorenson	13810
Gelfoam (Gelatineschwamm)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Niedriger Schmelzpunkt
Rundes Deckglas	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (Zahnzement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Sonderanfertigung (siehe Abbildung 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-Photonen-Mikroskop	Zeiss	LSM7MP
Titan-Saphir-Laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanplatte	Authors	-	Custom made (siehe Abbildung 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M