Biolumineszenz-Bildgebung zur Untersuchung von Kalziumtransienten in Drosophila-Gehirnstrukturen

Zusammenfassung

Quelle: Lark, A. R., et. al., In-vivo-Ansatz zur funktionellen Bildgebung des Gehirns basierend auf dem biolumineszierenden Calciumindikator GFP-Aequorin. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumdynamik mit Green fluoreszierende Protein-Aequorin-Biolumineszenz in den tiefen Hirnstrukturen von Drosophila.

Protokoll

1. Imaging

1. Einrichtung
   1. Starten Sie das Aufnahmesystem, indem Sie das Mikroskop, den Computer, die Kamera und das Entwässerungssystem einschalten und die Umgebungssteuerung des Raumes auf 25 °C einstellen.
   2. Öffnen Sie das Programm Measurement and Automation Explorer auf dem Computer. Klicken Sie auf "Devices and Interfaces", doppelklicken Sie dann auf "NI Motion Devices" und klicken Sie schließlich mit der rechten Maustaste auf "PCI-7334" und wählen Sie "Gerät initialisieren".
   3. Öffnen Sie Photon Imager. Erstellen Sie einen neuen Ordner und benennen Sie die erste Aufnahmedatei. Die Kamera muss -80 °C erreichen, bevor das System funktioniert.
   4. Richten Sie das Perfusionssystem ein: Geben Sie KCl (Kaliumchlorid), Nikotin und Ringer-Lösung in die Reservoire und stellen Sie sie so ein, dass jede Lösung mit 2 ml/min abgegeben wird. Waschen Sie sich vor Beginn des Experiments mit Ringer-Lösung.
2. Vorbereiten sample
   1. Platzieren Sie die Halterungsblockschale auf dem Passepartout unter einem Mikroskop bei 5-facher Vergrößerung und führen Sie den Perfusionsschlauch durch die Punktion in den Kanal ein.
   2. Stellen Sie das Mikroskop auf den Fluoreszenzmodus, zentrieren Sie es und stellen Sie die Pilzkörper (MBs) in den Fokus. Auf 20X einstellen, neu zentrieren und fokussieren.
   3. Positionieren Sie das Entwässerungsgerät über dem Entwässerungsbecken, stellen Sie die Höhe des Entwässerungsshunts so ein, dass sich die Spitze knapp über dem Becken befindet, und lassen Sie die Ringer-Lösung 30 Sekunden lang laufen, um eine ausreichende Entwässerung zu gewährleisten.
   4. Ziehen Sie die Abschirmung herunter, um das Gerät gegen Licht abzudichten. Nehmen Sie mit dem automatisierten System im Photonen-Imager Feineinstellungen am Fokus vor und erstellen Sie ein Referenz-Fluoreszenzbild der MBs.
3. Aufnahme
   1. Passen Sie die Photonengeschwindigkeit an die gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit an (von 50 ms bis zu 1 Sekunde oder mehr). Wählen Sie den Photonenmodus und öffnen Sie den Verschluss. Notieren Sie Genotyp, Geschlecht, Alter und Probennummer in Protokolleinträgen. Passen Sie die Position der ROI-Felder (Region of Interest) über Kelch- und Zellkörpern (CCB) und Medialappen an, indem Sie auf die ROI-Felder klicken und ziehen, während Sie die Kontrolle gedrückt halten.
   2. Nehmen Sie die Ausgangswerte etwa 5 bis 10 Minuten lang auf (je nach Wunsch).
   3. Tragen Sie Nikotin für 1 Minute auf. Notieren Sie Start/Stopp im Protokoll. Mit Ringer-Lösung 5 Min. waschen.
   4. Warten Sie 5 Minuten auf die Wiederherstellung und bereiten Sie den KCl-Protokolleintrag (Kaliumchlorid) und den Timer vor.
   5. Tragen Sie KCl 1 Minute lang auf. Notieren Sie Start/Stopp im Protokoll. 1 Min. mit Ringer-Lösung waschen.
   6. Wechseln Sie in den Fluoreszenzmodus, nehmen Sie das endgültige Fluoreszenzbild auf und schalten Sie die Ringer-Lösung aus.
   7. Drücken Sie "Stopp". In einem Dialogfeld werden Sie gefragt, ob Sie das System ausschalten möchten. Wählen Sie "Nein", um die Aufnahme fortzusetzen.
   8. Öffnen Sie die Abschirmung, bewegen Sie das Drainagesystem, schalten Sie das Objektiv auf 5X und entfernen Sie den Perfusionsschlauch. Nehmen Sie die Proben-/Aufnahmeschale vom Tisch und reinigen Sie das 20X-Objektiv, indem Sie das Objektiv zweimal mit Wasser spülen und abwischen.
   9. Drücken Sie die weiße Wiedergabetaste oben im Programmfenster, um die nächste Aufnahme zu starten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Calciumchlorid style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Kaliumchlorid	Prolabo	26 764.298
Magnesiumchlorid	Prolabo	25 108.295
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP<	A2383	Adenosin 5′-triphosphat Dinatriumsalzhydrat
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Katze #301 Coelenterazin h	http://www.prolume.com/
Tipps für Pipetten	Corning Incorporated	4868<
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (gekühlt auf -80°C)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Immersion objective lens<	N/A	20x Fluor .5w
Dissektionsmikroskop mit Fluoreszenz	Leica MZ Fl III	N/A	Leica Dissektionsbereich und fluoreszierende Lampe
Peristaltic pump	Gilson style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific<	Tygon R3603, St-Gobain
Perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	Perfusionsventil-Steuerungssystem, komplett, mit Quetschventilen, 6 Kanal
Perfusionsregler<	201108	Dosi-flow 3
Mess- und Automatisierungsexplorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380<
Photon imager<	N/A	software-http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380<
Excel<	N/A	software-https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	software-http://virtualdub.sourceforge.net/

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigma-Aldrichtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>100-1000μL Univesal Pipette Tiptd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:word;wrap-strategy:4;'>Nikontd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Abhängig von der Dicketd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Leventontr style='height:21px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Science Wares & National Instrumentstr style='height:21px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap-word;wrap-strategy:4;'>Microsoft