Gezielte neuronale Ablation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einer Zebrafisch-Larve

Abstract

Quelle: Muto, A., et al. Ablation einer neuronalen Population mit einem Zwei-Photonen-Laser und deren Beurteilung mittels Calcium-Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung bei Zebrafischlarven. J. Vis. exp. (2018)
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In diesem Video, Es wird ein Zwei-Photonen-Laserablationsverfahren demonstriert, das die selektive Zerstörung von fluoreszierenden Neuronen in Agarose-immobilisierten Zebrafischlarven ermöglicht. Die hochauflösende Bildgebung vor und nach dem Eingriff bestätigt eine effiziente neuronale Schädigung, die sich durch das Fehlen von Fluoreszenz zeigt.

Protocol

1. Ablation einer Subpopulation von Neuronen mit einem Zwei-Photonen-Lasermikroskop

1. Beginnen Sie mit der Einrichtung der Paarung einer Gal4-Linie, die bestimmte zu untersuchende Neuronen kennzeichnet, und UAS:EGFP oder UAShspzGCaMP6s. Stellen Sie sicher, dass Sie den nacre Hintergrund für beide Elternteile verwenden, so dass nacre Homozygoten erhalten werden können.
   HINWEIS: Homozygoten von nacre enthalten keine Melanophoren auf der Körperoberfläche (Abbildung 1B). In der vorliegenden Studie werden eine Gal4-Linie gSAIzGFFM119B (die das Prätectum markiert) und eine weitere Gal4-Linie hspGFFDMC76A (die den ILH (Lappen des Hypothalamus) markiert) verwendet.

2. Am nächsten Tag der Paarung sammeln Sie die Zebrafisch-Eier und heben sie in das Larvenstadium, wo die interessierenden Neuronen fluoreszierende Reporter exprimieren.

3. Montieren Sie die Zebrafischlarve in 2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Abbildung 1B).

1. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer 2%igen Agarose-Stammlösung: Lösen Sie 2 g Agarosepulver mit niedrigem Schmelzpunkt in 100 ml Systemwasser auf (d.h., das Wasser, das verwendet wird, um erwachsene Zebrafische in einem zirkulierenden Wassersystem zu halten) oder E3-Wasser, indem das Wasser in einer Mikrowelle zum Siedepunkt gebracht und kräftig gemischt wird.

   1. Erhitzen Sie die Agarose-Aktie mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 2 % in der Mikrowelle, bis sie kocht. Gießen Sie 3,5-4,0 ml der Agarose auf den Deckel einer 6 cm großen Petrischale. Warten Sie, bis die Agarose abgekühlt ist, damit sie sich warm anfühlt, bevor Sie fortfahren.

   2. Als nächstes legen Sie eine einzelne Larve (bei diesem Schritt nicht betäubt) in die Agarose. Stellen Sie die Position und Ausrichtung der Larve mit einer Präpariernadel so ein, dass sie aufrecht steht (Abbildung 1C), bis die Agarose erstarrt, um die richtige Positionierung der Larve zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Larve schwimmt weiter herum, während die Agarose erstarrt.

   3. Sobald die Larve positioniert ist, warten Sie 5 Minuten, bis sich die Agarose vollständig verfestigt hat.

   4. Gießen Sie 5 ml Tricainlösung (0,4% bei 1x Arbeitskonzentration) über die Agarose.
      HINWEIS: Um Bewegungen der Larven während der Laserablation zu vermeiden, müssen die Larven während des gesamten Ablationsvorgangs betäubt bleiben.

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4. p style='border-style:none;padding:0cm;'>Ablation der Larve mit der Bleaching-Funktion in einem Zwei-Photonen-Lasermikroskopie-System.

1. Legen Sie die in Agarose eingebettete Larve unter ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop und starten Sie das Mikroskopiesystem.

2. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware und klicken Sie auf die Schaltfläche "Ein" auf der Registerkarte "Laser", um den Laser einzuschalten (Abbildung 1D). Warten Sie, bis sich der "Status" des Lasers von "Beschäftigt" in "Modusgesperrt" ändert.

3. Auf der Registerkarte "Kanäle" stellen Sie die Wellenlänge des Lasers auf 880 nm (maximale Leistung: ca. 2.300 mW) für die EGFP-Ablation (Enhanced Green Fluorescent Protein) oder auf 800 nm (maximale Leistung: ca. 2.600 mW) für die GCaMP-Ablation ein.

4. Wählen Sie das 20X-Objektiv aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen. Klicken Sie auf die Registerkarte "Locate", klicken Sie auf "GFP" (Green Fluorescent Protein), um die optischen Signalwege zu ändern und die Fluoreszenz direkt mit dem Auge zu betrachten.

5. Lokalisieren Sie das Gehirn der Zebrafischlarve in der Mitte des Bildes; klicken Sie dann auf die Registerkarte "Erfassung", um zur Zwei-Photonen-Mikroskopie zurückzukehren.

6. Als Aufzeichnung der Bedingung 'vor der Ablation' nehmen Sie ein Z-Stack-Bild mit dem 20-fachen Objektiv mit hoher Scangeschwindigkeit auf (um Hitzeschäden zu vermeiden). Vergleichen Sie später die Bilder, die vor und nach den Ablationsexperimenten aufgenommen wurden (Abbildung 2A). Um einen Z-Stack zu erhalten, klicken Sie auf "Z-Stack", um die Option "Z-Stack" auszuwählen und die Registerkarte zu erweitern. Legen Sie die untere Grenze fest (klicken Sie auf die Schaltfläche "Zuerst setzen"), nachdem Sie sich auf das ventrale Ende des Larvenhirns konzentriert haben, und stellen Sie die obere Grenze (klicken Sie auf die Schaltfläche "Zuletzt einstellen") ein, nachdem Sie sich auf die dorsale Oberfläche des Gehirns konzentriert haben. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Experiment starten", um die Z-Stack-Bildaufnahme auszuführen.

7. Wählen Sie das 63X-Objektiv aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen.

8. Klicken Sie auf die Registerkarte "Locate", um zur Epifluoreszenzmikroskopie zu wechseln, lokalisieren Sie die Zellen, die abgetragen werden sollen, in der Mitte des Sichtbereichs durch das Auge, und klicken Sie dann auf die Registerkarte "Acquisition", um zur Laserscanning-Mikroskopie zurückzukehren.

5. Auf der Registerkarte "Erfassungsmodus" legen Sie die "Frame-Größe" auf 256 x 256 fest. Klicken Sie auf "Live" und beobachten Sie die interessierenden Neuronen.

6. Beginnend von der dorsalen Seite, finden Sie eine Fokusebene, in der die zu abtragenden Zellen scharf sind.

7. Markieren Sie mit der Funktion "Regions" einen kleinen, kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von etwa einem Drittel der Zellgröße auf jedem Neuron als Region of Interest (ROI).

8. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 13.93 s/256 x 256 Pixel (134.42 μm x 134.42 μm) ein, was einer Laserverweilzeit von ca. 200 μs/Pixel oder 200 μs/0.5 μm entspricht. Legen Sie außerdem 4 Wiederholungen fest ('Iterationszyklus: 4'). Alternativ können Sie die Anzahl der Iterationen und die Scangeschwindigkeit optimieren, sodass eine ausreichende Ablation erreicht wird.

9. Führen Sie die 'Bleaching'-Funktion für die Ablation aus, in Kombination mit den 'Zeitreihen (2 Zyklen)' zur Abbildung der Probe (vor und nach der Ablation) und 'Regionen' (zum Festlegen der ROIs) oder gleichwertigen Funktionen in der verwendeten Software (Abbildung 1D) .

10. Durch den Vergleich des ersten Bildes (vor der Ablation) und des zweiten Bildes (nach der Ablation) im Zeitserienzyklus stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz in den Zielzellen nach dem Bleaching auf das im Hintergrundbereich beobachtete abnimmt (Abbildung 2B).

11. Wenn nach der Ablation immer noch Fluoreszenz vorhanden ist, erhöhen Sie die Anzahl der Iterationen.

12. Als nächstes verschieben Sie die Brennebene etwas tiefer (d.h., zur ventralen Seite) und wählen Sie die nächste Fokusebene, in der unablierte Zellen erscheinen.

13. Führen Sie die Bleichfunktion aus. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Zellen in der interessierenden neuronalen Struktur abgetragen wurden.

14. Nachdem Sie alle Fokusebenen durchlaufen haben, die die zu ablierenden neuronalen Strukturen abdecken, überprüfen Sie die Zellen auf aufgehobene Fluoreszenz. Wenn sich herausstellt, dass einige Zellen aufgrund unzureichender Ablation immer noch fluoreszieren, bestrahlen Sie sie erneut mit dem Laser, wie oben beschrieben.

15. Wenn die Larve nach der Laserbestrahlung aus der Agarose geborgen werden muss, versuchen Sie nicht, sie aus der Agarose zu pressen, da dies die Larve beschädigen könnte. Machen Sie stattdessen vorsichtig winzige Schnitte in der Agarose um die Larve senkrecht zur Körperoberfläche. Warten Sie dann, bis die Larve von selbst aus der Agarose herausschwimmt, wenn das Anästhetikum nachlässt.

16. Fahren Sie zur nächsten Larve für die Ablation fort oder führen Sie Kontrollexperimente mit einer anderen Population von Neuronen durch, die nicht an dem untersuchten Verhalten beteiligt sind.
    HINWEIS: Hier wurden als Kontrolle die Riechkolbenneuronen in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B-Larven mit dem gleichen oben beschriebenen Protokoll laserabliert (Abbildung 2A, rechts).

17. Warten Sie einige Stunden oder 1 Tag für die Genesung, bevor Sie mit der Ca-Bildgebung oder Verhaltensaufzeichnung fortfahren. Während dieser Erholungszeit überprüfen Sie den Gesundheitszustand der Larven (d.h.<span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>, normales spontanes Schwimmen, keine offensichtlichen Hitzeschäden um den abgetragenen Bereich, etc.) und entfernen Sie Larven, die Anzeichen zeigen von schlechter Gesundheit.

Results

Materials