Zwei-Photonen-Mikroskopie für die In-vivo-Bildgebung von Mikrogefäßen im Gehirn von Mäusen

Zusammenfassung

Source: Nishimura, C. et al. Quantifizierung der zerebralen Gefäßarchitektur mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation. J. Vis. (2016).

Dieses Video zeigt die In-vivo-Visualisierung von kortikalen Kapillaren im Gehirn von Mäusen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Es beschreibt die Schritte zur Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in eine anästhesierte Maus mit einem dünnschädeligen kortikalen Fenster, zur Vorbereitung des Aufbaus für die Bildgebung und zur Aufnahme detaillierter Bilder von mikrovaskulären Strukturen des Gehirns für die Analyse.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs

1. Kneifen Sie die Haut einer betäubten Maus auf den medialen linken Oberschenkel mit der Pinzette #5. Ziehen Sie die Haut vorsichtig nach oben und verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu schneiden und zu entfernen. Bereiten Sie Dextran-konjugierten rot emittierenden Rhodaminfarbstoff (70 kDa) (10 mg/kg in Kochsalzlösung gelöst) vor.
2. Lokalisieren Sie die Oberschenkelvene. Ziehen Sie mit einer 1-ml-Spritze und einer aufgesetzten 30-G-Nadel eine zuvor hergestellte Lösung eines für die Bildgebung geeigneten Fluoreszenzfarbstoffs auf die 130-μl-Linie der Spritze. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie den Farbstoff vollständig in die Spritze ziehen und die Spritzenwand fest andrücken.
   1. Biege die 30 G Nadel in einem Winkel von etwa 30 Grad, indem du sie mit der abgeschrägten Seite nach oben gegen eine harte Oberfläche drückst. Füllen Sie die Nadel mit dem Farbstoff und entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit, so dass eine Probe von 100 μl übrig bleibt.
3. Injizieren Sie die 100 μl Farbprobe langsam in die Oberschenkelvene. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, üben Sie gleichmäßigen, sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um Blutungen zu stoppen. Lassen Sie die Farbe 5 min zirkulieren.
4. Schließen Sie den linken Oberschenkel, indem Sie die Haut mit einer 4-0-Naht zusammennähen, drehen Sie die Maus vorsichtig auf den Bauch und setzen Sie sie in den Gurt der Mauskopfplatte ein.
   

2. In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung

1. Bewegen Sie das chirurgische Gerät zum Zwei-Photonen-Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die kontinuierliche Anästhesie beibehalten wird. Geben Sie eine kleine Menge 0,9 % Kochsalzlösung in das Kopfplattenreservoir und senken Sie das Mikroskopobjektiv so ab, dass es mit der Kochsalzlösung in Berührung kommt. Lokalisieren Sie den interessierenden Bereich mit dem Hellfeld-Betrachtungsobjektiv.
2. Stellen Sie die Zwei-Photonen-Laseranregung auf eine Wellenlänge ein, die für den Fluoreszenzfarbstoff geeignet ist. Beginnen Sie mit der Zwei-Photonen-Bildgebung mit dem 25-fach-Objektiv.
   Beachten Sie, dass wir in diesen Experimenten ein Dextran verwendet haben, das an einen rot emittierenden Rhodaminfarbstoff konjugiert ist, der bei einer Wellenlänge von 780 nm angeregt wurde. Ein 607/36-Bandpassemissionsfilter wurde verwendet, um die Fluoreszenz des Farbstoffs zu detektieren, und ein 480/20-Bandpassemissionsfilter wurde verwendet, um die arterielle Autofluoreszenz zu detektieren.
3. Lokalisieren Sie ein Kapillarbett auf dem Bildschirm und vergrößern Sie diesen Bereich mit dem optischen Zoom 2. Nehmen Sie Bilder der Kapillaren mit der Zwei-Photonen-Bildgebungssoftware auf.

Materialien