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1. Erfassung von FLIM-Daten
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Lebensdauer des Fluorophors über die Zeitbereichs-TCSPC-Methode erfasst. FLIM erfordert, dass ein Lichtimpuls vom Laser mit einer festgelegten und konstanten Wiederholrate erzeugt wird. Die Wiederholrate variiert je nach Lasertyp und muss dem Benutzer bekannt sein. Lebensdauermessungen werden durch Detektoren und elektronische Geräte erreicht, die neben einem herkömmlichen Mikroskop installiert werden. In diesem Protokoll werden Messungen an drei verschiedenen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen durchgeführt, deren Detektoren und Software von zwei verschiedenen Unternehmen (Table of Materials) zur Erfassung der mRFP-, CFP- bzw. YFP-Lebensdauer bereitgestellt werden. Vergewissern Sie sich, dass die richtigen Emissions-/Anregungsfilter vorhanden sind, und minimieren Sie die Hintergrund- oder Monitorbeleuchtung, bevor Sie beginnen. Bevor Sie mit einem Experiment beginnen, stellen Sie die Photostabilität des gewählten Fluorophors her. Wenn das Fluorophor innerhalb kurzer Zeit im Nematodengewebe ausbleicht, ist es nicht für FLIM-Messungen in C. elegans geeignet.
- Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Die FLIM-Software ermöglicht auch die Steuerung des konfokalen Mikroskops. Suchen Sie die Registerkarte/Schaltfläche, um die Ausgänge des Detektors zu aktivieren, und drücken Sie Enable Outputs.
- Erwerben Sie die Instrument Response Function (IRF), die die Timing-Präzision des Instrumenten-Setups beschreibt.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte vorzugsweise vor dem Einsteigen der Nematoden durchgeführt werden. - Falls vorhanden, die Anregungs-/Emissionsfilter ausbauen.
- Platzieren Sie ein leeres Deckglas über dem Objektiv und suchen Sie dessen Oberfläche. Zeichnen Sie das vom Deckglas erhaltene Streusignal mindestens 30 s lang auf.
HINWEIS:{TAG_75}} Für Lebensdauern von mehreren Nanosekunden kann die Erfassungssoftware die IRF-Verschiebung automatisch schätzen. Der Erwerb eines IRF wird immer empfohlen.
- Legen Sie die Folie mit den montierten C. elegans auf die Bühne. Verwenden Sie eine Linse mit 10-facher Vergrößerung im Transmissionsmodus und lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Objektträger.
- Entfernen Sie den Objektträger, stellen Sie das Objektiv auf ein Objektiv mit 63-facher Vergrößerung um und tragen Sie das erforderliche Immersionsmedium (z. B. Öl) auf. Setzen Sie die Folie wieder auf den Tisch und lokalisieren Sie die Nematoden.
- Suchen Sie den Pinhole Manager in der Erfassungssoftware und öffnen Sie ihn für den Maximum. Beginnen Sie mit dem Scannen der Probe, wählen Sie einen Bereich von Interesse aus (z. B. Kopf, Oberkörper) und fokussieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene.
- Überwachen Sie die Laserpulsrate und die drei anderen Werte, die auf der Benutzeroberfläche der Software vorhanden sind: Der Konstante Fraktionsdiskriminator (CFD), der Time-to-Amplitude{TAG_131}} (TAC) und der Analog-Digital-Wandler{TAG_137}} (ADC).
HINWEIS: Der Laser sollte ein maximales Gate von 1 x 10{TAG_149}}8 Einzelphotonenzählungen haben. Diese Zahl stellt die maximale Anzahl der vom Laser gelieferten Photonen dar. Der CFD liefert Informationen über den Empfang des Einzelphotonenpulses in Bezug auf den Laserpuls durch den Detektor. Dieser Wert sollte ungefähr 1 x 105{TAG_158}} betragen. Der TAC unterscheidet zwischen dem Zeitpunkt, zu dem ein Photon detektiert wurde, und dem nächsten Laserpuls. Schließlich wandelt der ADC die TAC-Spannung in ein speicherbares Speichersignal um. CFD, TAC und ADC sollten alle ähnliche Werte haben, um sicherzustellen, dass die vom Fluorophor emittierten Photonen nicht verloren gehen. Die korrekte Auswertung dieser Parameter stellt sicher, dass genügend Photonen gesammelt werden, um eine genaue Lebensdauerkarte zu erstellen. - Zeigen Sie auf der Benutzeroberfläche der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an: Der ADC-Wert sollte zwischen 1 x 104 und 1 x 105 liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln.
HINWEIS: Im Allgemeinen sollte die Anzahl der aufgezeichneten Photonen pro Sekunde 1% der Wiederholrate des Lasers nicht überschreiten. - Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung in aus, um die Einzelphotonenerkennung zu ermöglichen.
- Stellen Sie die Erfassung auf eine feste Zeitspanne oder eine feste Anzahl von Photonen ein. Erfassen Sie z. B. eine Lebensdauer-Zerfallskurve für 2 Minuten oder bis ein einzelnes Pixel eine Photonenzahl von 2.000 Einzelereignissen erreicht. Drücken Sie Start, um mit der Erfassung zu beginnen.
HINWEIS: Unterschiedliche Fluorophore erfordern unterschiedliche Anregungs- und Emissionslaser und -filter. Abhängig von der Helligkeit der Probe kann auch die Laserleistung angepasst werden, was die Lebensdauer nicht beeinträchtigt. Diese Protokolle verwenden die folgenden Anregungs-/Emissionseinstellungen: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Ein gepulster Zwei-Photonen-Laser wurde für CFP-Messungen mit ex800/em440 nm eingesetzt. Der Zeitaufwand und die Photonenzahl, die für die Erfassung einer FLIM-Karte erforderlich sind, müssen für jeden Aufbau und jeden experimentellen Zweck empirisch ermittelt werden.
2. Analyse von FLIM-Daten mit der FLIMfit-Software
HINWEIS: Führen Sie die Datenanalyse mit dem am Imperial College London entwickelten FLIMfit-Softwaretool durch (siehe Abbildung 1).
- Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien über Datei | FLIM-Daten laden. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus unterschiedlichen biologischen Wiederholungen gewonnen wurden.
- Falls erforderlich, segmentieren Sie einen einzelnen Fadenwurm aus einem beliebigen FLIM-Bild über Segmentierung | Segmentierungs-Manager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis er hervorgehoben ist. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, drücken Sie OK.
HINWEIS: Die Segmentierung muss für alle Bilder durchgeführt werden. - Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C. elegans angezeigt wird (Abbildung 1, Pfeile 1). Die Abklingkurve dieses Bereichs wird im großen Abklingfenster auf der rechten Seite der Benutzeroberfläche angezeigt (Abbildung 1, Pfeil 2).
HINWEIS: Der Zerfall kann linear oder logarithmisch dargestellt werden. - Stellen Sie die richtigen Parameter ein, um die Lebensdauer über den Algorithmus der Software zu extrapolieren, wie in den Schritten 2.5-2.8 beschrieben.
- Auf der Registerkarte Daten (Abbildung 1{TAG_340}}, Pfeil 3):
- Festlegen eines beliebigen Integriertes Minimum zum Ausschließen von Pixeln, die zu dunkel sind, um einen gute Passform. Abhängig von der Stichprobe C. elegans variiert dieser Wert zwischen 40 und 300. Geben Sie unterschiedliche Werte ein, bis eine zufriedenstellende Vorschau erreicht ist.
- Wählen Sie eine Time Min und eine {Time Max, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu begrenzen. Alle Ereignisse, die vor und nach diesem Schwellenwert erscheinen, werden ausgeschlossen.
HINWEIS: Für die Analyse von mRFP wurden beispielsweise die Ereignisse vor 800 ps und nach 4.000 ps ausgeschlossen. Diese Werte hängen von der Lebensdauer des Fluorophors ab und müssen vom Endverbraucher bestimmt werden. - Ändern Sie nicht die Voreinstellung Counts/Photon von 1.
- Geben Sie die Wiederholrate des während der Erfassung verwendeten Lasers in MHz ein.
HINWEIS: Für das aktuelle Protokoll wurden verschiedene Laser mit unterschiedlichen Wiederholungsraten verwendet. Der Zwei-Photonen-Laser, der zur Erfassung der CFP-Lebensdauer verwendet wird, besitzt eine Wiederholrate von 80 MHz, für YFP wiederholt sich der Laser bei 40 MHz und für mRFP liegt der Wert bei 78,01 MHz. Diese Werte wurden entsprechend der analysierten Stichprobe in FLIMfit eingegeben. - Geben Sie einen Wert für Gate Max ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen.
HINWEIS: Für Lebensdauermessungen in C. elegans wird dieser Wert auf eine beliebige große Zahl gesetzt (z. B. 1 x 108).
- Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer eine zu verwendende globale Anpassung aus (z. B. eine pixelweise Anpassung). Siehe Abbildung 1, Pfeil 4.
HINWEIS: Eine Pixelweise Anpassung erzeugt einen Zerfall, der an jedes einzelne Pixel angepasst wird. Eine Bildbezogen Anpassung erzeugt eine globale Anpassung jedes einzelnen Bildes und zeigt einen einzelnen Lebensdauerwert pro Bild an. Eine Global-Anpassung erzeugt eine einzelne Anpassung für den gesamten Datensatz. Für alle Bilder wird ein einzelner Lebensdauerwert bereitgestellt. - Ändern Sie keine anderen Parameter außer der Nein. Exp Auswahl, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist.
HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wurde diese Funktion verwendet, um die Lebensdauer des biexponentiellen CFP-Fluorophors zu berechnen. - Laden Sie die IRF über das IRF-Menü hoch: IRF | IRF laden. Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF | Schätzen Sie die IRF-Verschiebung. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.
- Sobald alle Parameter eingestellt sind, drücken Sie Fit Dataset (Abbildung 1, Pfeil 5). Der Algorithmus erstellt eine Anpassung an die Abklingkurve und legt einen Lebensdauerwert für jedes Bild fest.
HINWEIS: Die resultierende Passform, die in einer blauen Linie hervorgehoben ist, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Anpassung wird erzielt, wenn alle Ereignisse entlang der Anpassung ausgerichtet sind. - Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter (Abbildung 1, Pfeil 6), die sich in den oberen rechten Menüs der Benutzeroberfläche der Software befindet, und wählen Sie Statistik: w_mean (gewichteter Mittelwert){TAG_594}} und überprüfen Sie, ob die chi2{{ TAG_598}} Wert liegt so nah wie möglich an 1.
HINWEIS: A chi2 in der Nähe von eins gewährleistet die Genauigkeit der Passform. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird daher als tau_1 angezeigt. - Exportieren Sie alle Informationen, die Sie interessieren: Datei | Intensitätsbilder exportieren/Ergebnistabelle anpassen/Bilder/Histogramme. Speichern Sie die Dateneinstellungen, die zur Berechnung der Lebensdauer verwendet werden: Datei | Einstellungen für Speicherdaten.
HINWEIS: Die verwendeten Parameter werden für die zukünftige Analyse der ausgewählten Proben gespeichert.
3. Grafische Darstellungen von FLIM-Daten
HINWEIS: Die Lebensdauern, die aus verschiedenen Proben gesammelt wurden, können auf verschiedene Weise visuell dargestellt werden. Wählen Sie diese Option aus, um die Lebensdauerwerte entweder in Nanosekunden oder Pikosekunden anzugeben.
- Zeigen Sie die Qualität der Anpassung und die Genauigkeit der Kurve an, indem Sie die Abklingkurve direkt aus FLIMfit exportieren.
- Stellen Sie die Verteilung der Photonen dar, indem Sie die Häufigkeit der Photonenzahl im Vergleich zum Lebensdauerwert in einem Histogramm darstellen.
- Wenn Sie schließlich zwei oder mehr Stichproben vergleichen, platzieren Sie für den statistischen Vergleich die Lebensdauerwerte plus die Standardabweichung des Mittelwerts in einem Balkendiagramm des Streudiagramms. Führen Sie jede gewünschte statistische Analyse durch.
