Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in retinalen Zapfen-Photorezeptoren von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Kulkarni, M. et al. Bildgebung von Ca²⁺ Dynamik in den Axon-Terminals der Zapfen-Photorezeptoren der Netzhaut der Maus. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in Zapfen-Photorezeptoren einer transgenen Mausnetzhaut. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung von Netzhautschnitten, zur Bildgebung von FRET-basierten Kalzium-Biosensoren und zur Analyse von Fluoreszenzänderungen zur Quantifizierung des Kalziumspiegels unter Hintergrundbeleuchtung und Lichtstimulation.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung der Scheiben (10 - 15 min)
   1. Vorbereiten der Nitrozellulose-Filtermembranen für das Schneiden der Netzhaut und Glasdeckgläser zum Montieren der Schichten und deren Überführung in die Aufnahmekammer. Schneiden Sie die Nitrozellulose-Filtermembran mit einer Schere in ca. 10 x 5 mm große rechteckige Stücke. Schneiden Sie Deckgläser mit einem Glasschneider in ca. 10 x 5 mm große rechteckige Stücke.
   2. Tauchen Sie einen Objektträger langsam in die extrazelluläre Lösung in der Nähe des Gewebes. Ziehen Sie die Netzhautscheibe aus der Biosensor-Maus HR2.1:TN-XL Ca²⁺ vorsichtig mit der Ganglienzellseite nach oben auf den Objektträger, indem Sie sie mit einer Pinzette ganz am Rand greifen. Dieser Prozess reduziert die mechanische Beschädigung und Faltung des Gewebes.
   3. Wählen Sie die Region der Netzhaut, die sich auf die jeweilige Forschungsfrage bezieht. Schneiden Sie mit einer gebogenen Skalpellklinge ein rechteckiges, ca. 1 x 2 mm großes Stück aus der ausgewählten Netzhautregion heraus. Wischen Sie überschüssige Lösung um das Gewebe herum ab.
   4. Platzieren Sie die Filtermembran so auf dem Netzhautstück, dass die Seite der Ganglienzellen an der Membran haftet. Geben Sie sofort einen Tropfen extrazelluläres Medium auf die Membran, um das Gewebe fest an der Membran zu befestigen.
   5. Übertragen Sie das membrangelagerte Netzhautgewebe in die Schneidekammer mit frischer extrazellulärer Lösung.
   6. Schneiden Sie die Netzhaut in vertikale Scheiben von 200 μm Dicke (Abbildung 1B) mit einer frischen Rasierklinge, die an einem Gewebezerkleinerer befestigt ist. Wechseln Sie die Klinge für jedes Netzhautstück.
      Hinweis: Die Rasierklinge muss perfekt auf die Oberfläche des Schneidekammerbodens ausgerichtet sein, so dass sich die gesamte Membran gleichzeitig spaltet, was durch ein "Klicken"-Geräusch beim Schneiden angezeigt wird. Andernfalls kann sich die Klinge verbiegen und die Scheibe beschädigen.
   7. Kleben Sie eine einzelne membranmontierte Scheibe auf ein Glasdeckglas, indem Sie nur die Membranenden mit Hochvakuumfett beauftragen (Abbildung 1C). Halten Sie die Glasoberfläche unterhalb der Netzhaut fettfrei.
   8. Bewahren Sie die auf dem Deckglas montierten Scheiben, die mit einem Tropfen extrazellulärer Lösung bedeckt sind, in der Haltekammer auf – einem geschlossenen und lichtdichten Behälter, , z. B. einer Petrischale, deren Deckel mit Aluminiumfolie bedeckt ist – unter einer Carboxygen-Atmosphäre bei Raumtemperatur (RT) auf. Führen Sie Carboxygen ein, indem Sie ein kleines Wasserreservoir sprudeln, um die Atmosphäre in der Warmhaltekammer befeuchtet zu halten. Dadurch wird ein Austrocknen der Scheiben verhindert.
   9. Lassen Sie die Scheiben 10 - 15 Minuten in der Warmhaltekammer ruhen, bevor Sie sie (eine nach der anderen) in die Aufnahmekammer bringen. Die Scheiben können bis zu 4-5 Stunden in einer Warmhaltekammer bei RT (~21 °C) aufbewahrt werden.

2. Zwei-Photonen-Ca²⁺ Bildgebung

1. Zwei-Photonen-Mikroskopie
   1. Verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Mikroskop vom Typ Movable Objective Microscope (MOM).
      Hinweis: Jedes aufrechte Zwei-Photonen-Mikroskop, das die folgenden Mindestanforderungen erfüllt, kann verwendet werden: Es muss mit (a) einem gepulsten Laser ausgestattet sein, der auf ~860 nm abstimmbar ist, (b) mindestens zwei gleichzeitig erfasste Fluoreszenzkanäle, (c) Filter für verstärkte Cyan-Fluoreszenzprotein (eCFP) und Citrinfluoreszenz, (d) ein Lichtstimulator und (e) Software, die es ermöglicht, Zeitraffer-Bildsequenzen mit einer Bildrate aufzunehmen, die ausreicht, um die interessierenden Ca²⁺-Signale aufzulösen.
   2. Starten Sie das Zwei-Photonen-Bildgebungssystem wie vom Hersteller angegeben. Befolgen Sie strikt die Lasersicherheitsrichtlinien der Einrichtung. Starten Sie den Laser und stimmen Sie ihn auf ~860 nm ab.
   3. Übertragen Sie eine Scheibe aus der Haltekammer in die Aufnahmekammer und beginnen Sie sofort mit der Perfusion mit carboxygenierter extrazellulärer Lösung. Halten Sie eine Perfusionsflussrate von 2 ml/min und eine Temperatur von 37 °C in der Aufnahmekammer aufrecht.
   4. Verwenden Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit 20 x 0,95 numerischer Apertur (NA). Falls verfügbar, verwenden Sie eine CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) in Kombination mit einer Infrarot-Leuchtdiode (LED) unterhalb der Aufnahmekammer, um den Netzhautschnitt zu lokalisieren (Abbildung 2). Andernfalls lokalisieren Sie die Scheibe mit Hilfe von Zwei-Photonen-Bildgebung (siehe 2.1.5).
   5. Wechseln Sie zur Zwei-Photonen-Bildgebung, um die Expression von Biosensoren anzuzeigen. Schalten Sie die beiden Detektionskanäle für die Fluoreszenzbildgebung von eCFP und Citrin ein.
   6. Verwenden Sie die Bilderfassungssoftware, die das Zwei-Photonen-Mikroskop steuert, um eine Reihe von Kegelanschlüssen für die Aufzeichnung zu scannen und auszuwählen (Abbildung 3A). Stellen Sie die Bildaufnahme auf Bilder mit 128 x 16 Pixeln (31,25 Hz) oder eine ähnliche Konfiguration ein. Beschränken Sie den gescannten Bereich auf die Kegelenden, um ein Ausbleichen von Photopigmenten in den äußeren Segmenten zu vermeiden.
      Hinweis: Für den TN-XL Calciumsensor (τ = ~0,6 sec für Ca²⁺ Bindung, τ = ~0,2 sec für Ca²⁺ Unbinding) wird eine minimale Bildrate von ~8 Hz empfohlen.
   7. Lichtstimulation und -aufzeichnung
      1. Verwenden Sie einen Vollfeld-Lichtstimulator auf der Unterstufe, um die folgenden Schritte auszuführen.
         Hinweis: Eine einfache Lösung für einen Vollfeld-Lichtstimulator besteht darin, zwei bandpassgefilterte LEDs (, z. B. "blau": 360 Bandpass (BP) 12, "grün": 578 BP 10) zu verwenden, die der Wellenlängenempfindlichkeit von Mauszapfen entsprechen, sich aber gleichzeitig nicht mit den für die Fluoreszenzdetektion verwendeten Filtern überlappen. Das Licht der LEDs wird durch den Kondensor durch den Boden der Aufnahmekammer fokussiert (Abbildung 2).
      2. Schalten Sie den Laser ein und lassen Sie die Kegel sich an den Scanlaser und das Stimulus-Hintergrundlicht anpassen (20 - 30 Sekunden), bevor Sie Lichtreize abgeben (siehe 2.2.3) oder pharmakologische Wirkstoffe anwenden.
      3. Starten Sie die Darstellung beliebiger Reize (, z. B. Lichtblitze, wie in Abbildung 3B, C gezeigt). Im Falle des in Schritt 2.2.1 beschriebenen Stimulators erzeugen Sie die Reize, indem Sie die Intensität der beiden LEDs über die Zeit modulieren, indem Sie eine Mikroprozessorplatine verwenden, die von einer kundenspezifischen Software gesteuert wird.
      4. Starten Sie die Aufnahme der beiden Fluoreszenzkanäle (z.B., bei 483 nm für "blau"
   8. Förster Resonanzenergietransfer (FRET)-Donor eCFP und bei 535 nm für "gelben" FRET-Akzeptor) gleichzeitig mit der entsprechenden Bildaufnahmesoftware (siehe auch 2.1.6). Nehmen Sie z.B. bei Lichtblitzen (Abbildung 3B, C) mindestens 8 - 10 Reizpräsentationen (Versuche) auf.

Ergebnisse

Abbildung 1. Präparation von vertikalen Netzhautschnitten. (ein) Isolierte und abgeflachte Netzhaut, die zum Schneiden vorbereitet wurde. (B) Rechteckiges Stück Netzhaut (siehe roter Kasten in A), das nach dem Schneiden auf ei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hochvakuumfett	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Deckgläser	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Glasschienen	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Klingen für Gewebezerkleinerer	MARTOR KG	ARGENTAX Nr. 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Gewebezerkleinerer	Sonderanfertigung
Nitrozellulose-Filtermembran gerastert	Merck Millipore	AABG01300	Filtertyp: 0,8 μm; http://www.emdmillipore.com
UV/Grün LED-basierter Vollfeldstimulator	Maßgeschneidertes
Open-Source-Mikroprozessorboard	Arduino		http://www.arduino.cc
Imaging-Software			entwickelt von Michael Müller, MPI für medizinische Forschung, Heidelberg, Deutschland
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Systemfokus Perfusionssystem	ALA Wissenschaftliches Instrument		Mit Spitzenverteiler mit 100 μm Durchmesser; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Saphir-Laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Bewegliches Objektivmikroskop (MOM), entworfen von W. Denk, MPImF, Heidelberg, Deutschland	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0,95w Objektiv	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/

CfNT Kundenspezifisch