Lebendzell-Bildgebung der Müller-Gliakernmigration während der Netzhautregeneration von Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Lahne, M., et.al. Kultur von adulten transgenen Zebrafisch-Netzhaut-Explantaten für die Bildgebung lebender Zellen mittels Multiphotonenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Live-Zell-Bildgebung der Kernmigration von Müller-Gliazellen in Agarose-eingebetteten Zebrafisch-Netzhautexplantaten nach lichtinduzierter Photorezeptorschädigung. Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), der von geschädigten Photorezeptoren freigesetzt wird, aktiviert Müller-Gliazellen und löst die Kernmigration durch die inneren und äußeren Kernschichten für die Mitose und die Bildung neuronaler Vorläuferzellen aus. Die aufgenommenen Bilder zeigen die Dynamik der Kernmigration und der Vorläuferdifferenzierung während der Netzhautregeneration.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierproben zum Einsatz kommen, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Multiphotonenmikroskopie

HINWEIS: Die in diesem Manuskript durchgeführten Experimente wurden für ein Multiphotonenmikroskop optimiert, das mit einem Infrarotlaser (siehe Materialtabelle), einem 40X Apo Langstrecken-Wasserimmersionsobjektiv (N.A. 1.15), einem Galvanometer-Scanner und einer Klimakammer ausgestattet ist, die einen Einsatz für vier 35-mm-Petrischalen enthält. Die Bilder wurden mit einem nicht-degescannten Detektor (R-NDD) aufgenommen.

1. Vor der Bildgebung ist die Klimakammer äquilibrierbar, um eine Atmosphäre von 5 % CO₂/Luft zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass leere Petrischalen in die Halterung eingesetzt werden, um ein Austreten von Gas in den Raum zu vermeiden.
2. Schalten Sie das Mikroskopiesystem ein.
3. Sobald die Klimakammer ausgeglichen ist, geben Sie Brechungsindexflüssigkeit auf das 40X Apo Langzeit-Wasserimmersionsobjektiv (N.A. 1.15).
   HINWEIS: Die Brechungsindexflüssigkeit mit ähnlichen optischen Eigenschaften wie Wasser wird verwendet, um die Verdunstung von Wasser während der Langzeitbildgebung zu vermeiden.
4. Legen Sie Fluoroschalen mit retinalen Explantaten in die Kammer. Positionieren Sie die Probe mit Hellfeldlicht in den Strahlengang und bringen Sie den Mittelbereich der dorsalen Netzhaut in die Fokusebene.
5. Verwenden Sie GFP-Epifluoreszenzlicht, um auf gfap:nGFP-positive Müller-Gliakerne zu fokussieren (Abbildung 1A, C).
   HINWEIS: Wenn Explantate nicht flach gelagert werden oder sich Agarose unter dem Explantat ansammelt, ist es schwierig, auf die gfap:nGFP-positiven Kerne zu fokussieren, da sie schwach fluoreszieren.
   1. Prüfe, ob der Wechsel zu einer anderen Region innerhalb desselben retinalen Explantats das Fokussierungsproblem lösen wird. Andernfalls wechseln Sie zu einem anderen Netzhautexplantat.
6. Öffnen Sie in der Bildaufnahmesoftware die Fenster "A1 MP GUI", "TiPad", "A1 Compact GUI" und "ND Erfassung". Stellen Sie für die Multiphotonen-Bildgebung sicher, dass die Option "IR NDD" in der "A1 Compact GUI" ausgewählt ist.
7. Wählen Sie im Feld "Einstellung" IR-DM für den 1. dichroitischen Spiegel und wählen Sie den Bandpassfilter 525/50 zur Erfassung der GFP-Fluoreszenz
.
8. Schalten Sie den IR-Laser im Fenster mit der Bezeichnung "A1MP GUI" ein. Es dauert einige Minuten, bis der Laser bereit ist. Stellen Sie die Wellenlänge auf 910 nm ein, um die GFP-Fluoreszenz anzuregen und den Laser auszurichten, indem Sie auf die Schaltfläche "Automatische Ausrichtung" im Fenster "A1 MP GUI" klicken.
9. Stellen Sie sicher, dass die Raum- und Gerätebeleuchtung ausgeschaltet oder abgedeckt ist, bevor Sie den Verschluss in der "A1 MP GUI" öffnen, um eine Überbelichtung des Photomultiplier-Tubus zu vermeiden. Um den Geräuschpegel zu reduzieren, stellen Sie das Mikroskop in einer abgedunkelten Umgebung auf.
10. Erfassen Sie Bilder mit einem Sichtfeld von 300 x 300 Pixeln, einem Zoom von zwei Pixeln und einer Pixelverweilzeit von 4,8 μs/Pixel. Stellen Sie die Laserleistung grob ein, indem Sie den "Erfassungsbereich" in der "A1MP GUI" und die Verstärkung im "A1 Compact GUI"-Fenster ändern.
11. Einrichten des Z-Stacks
    1. Fokus auf die Ganglienzellschicht (GCL), um die obere Fokusebene des Z-Stacks im 'z'-Unterfenster innerhalb des 'ND Acquisition'-Fensters festzulegen. Einige gfap:nGFP-positive Zellen befinden sich typischerweise in der Ganglienzellschicht, was hilft, die basale Grenze der Netzhaut zu identifizieren (Abbildung 1A, D).
    2. Bewegen Sie die Fokusebene durch die Ebene der äußeren Kernschicht (ONL) (Abbildung 1A, B), die durch das Vorhandensein von schwach markierten gfap:nGFP-positiven Zellen gekennzeichnet ist, die im Vergleich zu ihren Gegenstücken in der inneren Kernschicht (INL) rund und vergrößert sind (Abbildung 1A, C).
    3. Legen Sie diese Ebene als unteren Rand des Z-Stapels fest. Stellen Sie sicher, dass die gesamte ONL abgebildet wird (Abbildung 1A, B).
    4. Wenn Verschiebungen der Fokusebene auftreten, die während der Bildgebungszeit neu angepasst werden müssen, doppelklicken Sie auf die mittlere Position im Unterfenster "z", um sie als "Ausgangsposition" zuzuweisen. Wechseln Sie zu 'symmetrischer Modus definiert' und klicken Sie auf 'relativ'.
    5. Stellen Sie die Z-Schrittgröße zwischen 0,7 und 1 μm ein.
12. Z-Intensitätskorrektur:
    1. Wendet Z-Intensitätskorrekturen an, um den Verlust der Pixelintensität aufgrund von Lichtstreuung bei der Bildgebung in tiefen Gewebeschichten zu kompensieren.
    2. Um die Korrektur einzurichten, öffnen Sie das Fenster "Z-Intensitätskorrektur". Um den 'Z-Stack-Bereich' einzustellen, wählen Sie 'From ND'.
    3. Klicken Sie im Fenster "z-Intensitätskorrektur" auf die untere Fokusebene (entspricht in diesem Fall der Ganglienzellschicht) und stellen Sie die Laserintensität ("Erfassungsbereich" in der "A1MP GUI") und die Verstärkung (A1 Compact GUI) ein.
    4. Klicken Sie auf den Pfeil neben den "Z-Werten" im Fenster "Z-Intensitätskorrektur", um die Einstellungen zu bestätigen, die anschließend unter "Geräteeinstellungen" im Fenster "Z-Intensitätskorrektur" für die gewählte Fokusebene angezeigt werden.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang für die mittlere und obere Ebene, um die Laserleistung und -verstärkung zu erhöhen. Bei Bedarf können zusätzliche Fokusebenen hinzugefügt werden. In Tabelle 1 finden Sie die spezifischen Laser- und Verstärkungseinstellungen für Experimente in den Abbildungen 1 - 3.
    6. Legen Sie den "Erfassungsbereich" im Fenster "A1 MP GUI" fest. Vermeiden Sie es, zu Beginn der Bildgebung einen Aufnahmebereich größer als 15 und eine Verstärkung von mehr als 126 zu wählen, um Photobleaching und erhöhte Rauschpegel zu vermeiden.
       HINWEIS: Da sich Laser und Photomultiplier-Röhren zwischen den Mikroskopiesystemen unterscheiden, sollten Sie die Laser- und Verstärkungseinstellungen testen, um optimale Bildgebungsbedingungen für die Mikroskopeinrichtung zu erhalten und gleichzeitig Photobleaching zu vermeiden.
    7. Wählen Sie "Relative Intensitätskorrektur" im Fenster "Z-Intensitätskorrektur".
13. Stellen Sie im Unterfenster 'Zeitreihe' im Fenster 'ND-Erfassung' die Dauer auf 8 h und das Intervall auf 'keine Verzögerung' ein. Stellen Sie dann sicher, dass Sie auf die Schaltfläche "Z-Korrektur" im Unterfenster "Z-Stapel" klicken, um die 3D-Zeitreihen zu erfassen.
14. Halten Sie die Netzhautexplantate während der gesamten Dauer der Bildaufnahme bei einer Temperatur von 27 - 29 °C.
15. Passen Sie während der gesamten Bildaufnahmephase bei Bedarf den Leistungspegel und die Verstärkung an, um die Bildqualität für die Analyse nach der Bildgebung zu erhalten. Für Anpassungen führen Sie die Schritte 1.11.2 - 1.11.4 durch.
16. Wenn sich die Brennebene verschiebt, unterbrechen oder stoppen Sie den Lauf und führen Sie Schritt 1.11 erneut aus.
    HINWEIS: Wenn in Schritt 1.12.7 und Schritt 1.11.4 die Option "Relative Z-Korrektur" ausgewählt wurde, sollte es nicht erforderlich sein, die Leistung und die Verstärkungspegel neu einzustellen, es sei denn, es trat ein umfangreiches Photobleaching auf.

Tabelle 1: Laser- und Verstärkungspegel, die für die Korrektur der Z-Intensität in den verschiedenen Ebenen für Experimente verwendet werden, dargestellt in den Abbildungen 1 - 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Laserleistung	Verstärkung	Laserleistung	Verstärkung
Oben (Stäbchen-Photorezeptor)	13	126	3,5	118
Mittel (Müller-Glia)	10	126	2,8	118
Untere (Ganglienzellschicht)	8	126	2,1	118

Ergebnisse

Abbildung 1: 3D-Rekonstruktion von retinalen Multiphotonen-Z-Stacks. A) 3D-Rekonstruktion einer Multiphotonen-Z-Stapel-Bildserie von gfap:nGFP-positiven Zellen in retinalen Ganz-Mount-Kulturen von Zebrafischen nach 48 h Lichtschädigung....

Materialien