Bildgebung von Hirnschäden, die durch zerebrale Hypoxie-Ischämie induziert werden, in einem Mausmodell

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Einseitige Ligatur der Arteria carotis communis (CCA)

1. Bereiten Sie ein steriles Feld mit sterilisierten chirurgischen Instrumenten und Materialien vor, die bequem positioniert sind. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen auf 37 °C erwärmt ist, wobei der Temperaturfühler sicher auf dem Pad platziert ist. Achten Sie darauf, ein steriles Abdecktuch zu verwenden, um die Operationsstelle abzudecken.
2. Betäuben Sie das Tier (Isofluran, 1-3 % an der Luft bei 0,5-1 l/min) und bringen Sie das Tier in Rückenlage mit dem Schwanz nach weg. Überprüfen Sie die Betäubung, indem Sie den Zeh einklemmen - dies sollte keine Reaktion hervorrufen, wenn das Tier richtig betäubt wird. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf.
3. Tragen Sie die Enthaarungscreme mit 1-2 Wattestäbchen auf den unteren Hals- bis zum oberen Brustbereich auf. Warten Sie 1-3 Minuten und entfernen Sie dann Haare und Creme mit feuchten Mull- oder Alkoholtupfern. Tupfen Sie den Schnittbereich mit Betadin kreisförmig von innen nach außen ab und wechseln Sie dann in sterile OP-Handschuhe.
4. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von ca. 1 cm entlang der Mittellinie des unteren Halses. Trennen Sie die Außenhaut vorsichtig mit einer chirurgischen Schere von der umgebenden Faszie.
5. Trennen Sie mit zwei McPherson Mikro-Iris-Nahzangen die rechte Halsschlagader von den Faszien und achten Sie darauf, dass die Venen nicht beschädigt oder der Vagusnerv gestört wird.
6. Mit der Pinzette auf der rechten Seite den rechten CCA in einer stabilen Position nach außen führen. Tragen Sie mehrere Tropfen Kochsalzlösung auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Führen Sie eine geeignete Länge (2-3 cm) einer 6-0 Seidennaht unter den rechten CCA und ligieren Sie mit einem doppelten quadratischen Knoten. Optional können Sie erneut mit einer zweiten Länge von 6-0 Seidennaht ligieren.
7. Positionieren Sie den rechten CCA neu und reinigen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem sterilen Schwammtupfer aus dem Öffnen. Verschließen Sie den Schnitt mit einer 6-0 Seidennaht. Lidocain topisch bis zu 7 mg/kg auftragen.
8. Lassen Sie das Tier sich von der Narkose erholen, bis es ambulant ist (ca. 30 Minuten), und führen Sie eine postoperative Überwachung durch, bis das Tier für die Bildgebung bereit ist.

2. Vorbereitung für die Bildgebung: System- und Hardware-Checks

1. Richten Sie Hard- und Software für die MRT- und PET-Systeme ein und überprüfen Sie deren Funktionsfähigkeit wie folgt. Stellen Sie sicher, dass alle physischen Verbindungen sicher sind und die Softwareeinstellungen entsprechend ausgewählt sind.
   1. Stellen Sie sicher, dass das PET-System mit dem Luftkühlsystem die vorgeschriebene Betriebstemperatur von 5 °C hat.
   2. Montieren Sie das PET-System in der MRT-Bohrung und richten Sie die PET- und MRT-Sichtfeldzentren (FOV) mit bekannten axialen Versätzen aus. Montieren Sie die MRT-Spule in der Bohrung des PET-Systems und zentrieren Sie die Spule mit dem PET-System und den MRT-Magnetzentren.
   3. Schalten Sie die PET-Elektronik für Strom und Vorspannung ein (Hinweis: Die Schritte variieren je nach Gerät). Führen Sie einen schnellen Scan (5 Minuten) mit einem 68-Ge-Zylinder durch und überprüfen Sie das resultierende Sinogramm, um sicherzustellen, dass alle Detektoren betriebsbereit sind.
   4. Erfassen Sie optional Daten, die für eine PET/MRT-Transformationsmatrix für Co-Registrierungszwecke verwendet werden können: Füllen Sie ein dreidimensionales Phantom (z. B. drei gefüllte Kugeln) mit 200 μCi wässriger 18F-Lösung und erfassen Sie es 15 Minuten lang mit PET. Erfassen Sie anatomische MRT-Daten: Wählen Sie im Scan-Kontrollfenster die MSME-Sequenz (Multi-Slice Multi-Echo) aus (siehe Tabelle 1). Wiederholen Sie dies für alle drei Hauptausrichtungen: axial, sagittal und koronal.
2. Überprüfen Sie die Einstellungen und den Betrieb der Infusionspumpe. Stellen Sie die Pumpe auf 4,44 μl pro Minute ein, was bei 45 Minuten konstanter Infusion ein Gesamtvolumen von 200 μl ergibt, dem typischen empfohlenen Grenzwert für eine intravenöse (i.v.) Injektion bei einem 20-g-Tier.
3. Überprüfen Sie den Betrieb der Heizung und vergewissern Sie sich, dass die Temperaturabgabe ausreicht, um das Tier warm zu halten (37 °C). Prüfen Sie, ob die Temperatur- und Atemüberwachung betriebsbereit ist, um die Tierhaltung auf dem Tierbett vorzubereiten.
4. Überprüfen Sie die Funktion der O2- und N2-Durchflussmesser (für 0,5 l/min: O2 bei 57,2 mg/min und N2 bei 0,575 g/min), indem Sie beide bei ausgeschalteter Druckluftquelle und eingeschalteter O2- und N2-Quelle einschalten. Um das Risiko einer Beschädigung der Durchflussmesser zu vermeiden, schalten Sie sie nicht ohne ausreichenden Eingangsdruck ein.
5. Stellen Sie sicher, dass der Isofluran-Verdampfer ausreichend gefüllt ist. Beginnen Sie vor der Bildgebung mit dem Isofluran-Anästhesiefluss bei 1-2 % und 0,5 bis 1 l/min.
6. Bereiten Sie das Tierbett vor, indem Sie sicherstellen, dass die Anästhesie, das Beatmungskissen und die Heizungssysteme sicher und funktionsfähig positioniert sind. Für eine zusätzliche Genauigkeit der PET/MRT-Koregistrierung können Referenzmarker (z. B. Kapillarröhrchen, die mit Radiotracer in einer ähnlichen Konzentration gefüllt sind, wie sie für die Bildgebung injiziert werden) am Tierbett innerhalb des Sichtfeldes angebracht werden.

3. Arbeitsablauf der Bildgebung

Nachdem alle erforderlichen Geräteüberprüfungen abgeschlossen sind, fahren Sie wie folgt mit der Bildgebung fort:

1. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran und legen Sie einen Schwanzvenenkatheter (28 G Nadel, PE-10-Schlauch weniger als 5 cm) an, der mit heparinisierter Kochsalzlösung (0,5 ml Heparin, 1.000 USP/ml, in 10 ml Kochsalzlösung) gefüllt ist. Das Erwärmen des Tieres und/oder des Schwanzes kann die Genauigkeit des Kathetereinführs verbessern. Geben Sie optional einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf die Einführstelle, um den Infusionszugang zu sichern.
2. Setzen Sie das Tier in das vorbereitete Tierbett um. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres sicher sitzt, wobei die oberen Schneidezähne durch den Zahnsteg und die Ohrstangen gesichert sind, wenn sie verwendet werden.
3. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Rektalsondenthermometer einsetzen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur- und Atemwerte funktionsfähig sind.
4. Die zu injizierende Radiotracer-Dosis (ca. 600 μCi in 200 μl) wird in einen heparinisierten PE-10-Schlauch geeigneter Länge – ca. 3 m für PE-10-Schlauch und ein Volumen von 200 μl – aufgezogen. Ein Ende dieses Schlauchs wird an die Spritze der Infusionspumpe und das andere an die Katheterleitung der Schwanzvene angeschlossen. Achten Sie darauf, keine Einstiche in den Schläuchen zu verursachen.
5. Schieben Sie das Tierbett nach vorne in die Bohrung des Magneten und achten Sie darauf, die Positionierung der MRT-Spule und der Leitungen oder Kabel, insbesondere der Anästhesieschläuche, nicht zu stören. Stellen Sie sicher, dass das Zentrum des Gehirns mit den Zentren der MRT-Spule, des PET-Systems und des MRT-Magneten ausgerichtet ist.
6. Führen Sie die Abstimmung und Anpassung der MRT-Spule durch, indem Sie die Einstellknöpfe an der Spule drehen und Impedanz- (Spulenspezifikationen prüfen) und Frequenzabweichungen (300 MHz für 1H bei 7 Tesla) minimieren, indem Sie die Anzeige des Hochleistungsvorverstärkers beobachten.
7. (MRT) Nehmen Sie nach dem Einstellen und Abgleichen ein Scout-Bild auf: Wählen Sie eine RARE-Tripilot-Sequenz (Rapid Imaging with Refocused Echoes) aus und führen Sie die Sequenz im Scan-Steuerungsfenster aus. Überprüfen Sie die Positionierung des Tieres, wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 3.5 und 3.6. Setze die Unterlegscheiben auf den Nullwert zurück.
8. (MRT) Erfassen Sie einen lokalisierten, punktaufgelösten spektroskopischen Scan (PRESS) in einem Volumen im Gehirn: Führen Sie eine PRESS-Sequenz (siehe Tabelle 1) in einem rechteckigen Volumen mit den Abmessungen 3,9 mm × 6 mm × 9 mm aus. Überprüfen Sie die Breite der Wasserlinie mit dem Makrobefehl CalcLineWidth. Wenn der Wert für die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) akzeptabel ist (z. B. 0,2 ppm), fahren Sie mit Schritt 3.10 fort. Wenn nicht, fahren Sie mit Schritt 3.9 fort.
9. (MRT) Erfassen einer Feldkarte: Führen Sie eine FieldMap-Sequenz aus (siehe Tabelle 1). Verwenden Sie die resultierenden Daten für einen Mehrwinkel-Projektions-Shim (MAPSHIM), indem Sie den Makrobefehl MAPSHIM ausführen und lineare und lokale Anpassungen zweiter Ordnung (z2) auswählen. Wiederholen Sie Schritt 3.8.
10. (MRT) Positionieren Sie den Schnittplan für den diffusionsgewichteten Bildgebungsscan (DWI) (siehe Tabelle 1): Stellen Sie mit dem Geometrie-Editor sicher, dass das Aufnahmefeld so positioniert ist, dass es das gewünschte interessierende Volumen im Gehirn erfasst. Wenn der resultierende Slice-Plan wie gewünscht ausgerichtet ist, kopieren Sie diesen Slice-Plan im Scan-Steuerungsfenster für alle nachfolgenden DWI-Scans. Beginnen Sie mit der Akquise.
11. (PET) Wenn die PET-Aufnahme vorbereitet und bereit ist, die Infusionspumpe zu starten. Nach der vorgegebenen Verzögerung, in der Kochsalzlösung aus dem Katheter injiziert wurde, beginnen Sie mit der PET-Aufnahme (siehe Tabelle 1), um den Eintritt des Radiotracers zu erfassen. Überwachen Sie die Zählrate und achten Sie auf einen allmählichen Anstieg der Zählzahlen, der auf eine erfolgreiche Injektion hinweist.
12. Nach 10-15 Minuten beginnen Sie die hypoxische Herausforderung gleichzeitig mit Schritt 3.12. Um eine hypoxische Herausforderung auszulösen, schalten Sie den medizinischen Luftstrom aus und schalten Sie die O2- und N2-Durchflussmesser sofort mit den vorgegebenen Einstellungen ein, um 8 % Sauerstoff und 92 % Stickstoff zu liefern und Isofluran auf 0,8 % zu reduzieren. Schalten Sie keine Durchflussmesser ohne Eingangsdruck ein.
13. (MRT) Beginnen Sie gleichzeitig mit Schritt 3.12 mit der DWI-Erfassung, die in Schritt 3.10 vorbereitet wurde (Scan "H1").
14. (MRT) Beginnen Sie mit der DWI-Erfassung (Scan "H2"), die in Schritt 3.10 vorbereitet wurde, unmittelbar nach Abschluss des Scans H1. Beenden Sie hypoxische Herausforderungen, indem Sie Durchflussmesser ausschalten, den medizinischen Luftstrom wiederherstellen und die Isoflurankonzentration auf der Grundlage physiologischer Überwachung auf einen geeigneten Wert zurücksetzen.
15. (MRT) Machen Sie einen DWI-Scan nach Hypoxie, der in Schritt 3.10 erstellt wurde. Schalten Sie die Infusionspumpe aus, nachdem dieser Scan abgeschlossen ist.
16. (MRT) Erfassen Sie anatomische Bilder in der axialen und sagittalen Ebene. Wählen Sie im Scan-Steuerungsfenster die MSME-Sequenz aus (siehe Tabelle 1). Stellen Sie mit dem Geometrie-Editor sicher, dass das Aufnahmefeld das Gehirn abdeckt.
17. Entfernen Sie das Tier, kehren Sie in den Käfig zurück, wenn es gehfähig ist, und überwachen Sie es auf Anzeichen von Morbidität, euthanasieren Sie es erforderlichenfalls mit Verabreichung von CO2, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation als sekundäre Methode.

Tabelle 1. MRT-Pulssequenzparameter für Scans, die im Protokoll beschrieben sind, sowie PET-Erfassungs-, Histogramm- und Rekonstruktionsparameter.