Zeitraffer-Bildgebung von transfizierten primären Zellen der Großhirnrinde der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Landeira, B. S.,et al., Live-Bildgebung von primären Großhirnrindenzellen mit einem 2D-Kultursystem. J. Vis. Exp. (2017)

Das Video demonstriert die Verwendung von Zeitraffer-Bildgebung, um fluoreszenzmarkierte kortikale Vorläuferzellen zu verfolgen, ihre Teilung und Differenzierung zu überwachen und die Abstammungsentwicklung in primären Großhirnrindenzellen zu untersuchen

Protokoll

1. Zeitraffer-Videomikroskopie

HINWEIS: Dieser Schritt erfordert ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer Inkubationskammer (siehe Materialtabelle).

1. Nach der Retrovirusinfektion stellen Sie die Gewebekulturplatte in einen Inkubator, der mit Temperatur- und CO₂-Controllern verbunden ist.
   HINWEIS: Das Vorheizen der Kammer für 3 Stunden vor Beginn der Bildgebung kann dazu beitragen, Drift und Unschärfe während der Aufnahme zu minimieren.
   HINWEIS: Die Kammer sollte die Zellen unter konstanten Bedingungen von 37 °C und 5 % CO₂ halten.
2. Wählen Sie eine Position in der XY-Achse, die als Nullpunkt dienen soll (XY = 0). Dies ermöglicht eine Referenz, um die Positionen in Zukunft wieder zu finden.
   HINWEIS: Es ist ratsam, ein Zeichen auf die Platte zu zeichnen, das als Referenz zur Bestimmung des Nullpunkts verwendet werden kann.
3. Wählen Sie die Positionen aus, die bei 10-facher Vergrößerung abgebildet werden sollen.
   HINWEIS: Wählen Sie 10-15 Positionen pro Vertiefung, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, retroviral transfizierte Zellen zu beobachten.
   HINWEIS: Objektive mit großer Vergrößerung (20X oder 40X) können verwendet werden, um Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten. Abhängig vom Arbeitsabstand der Objektive können Glasbodenplatten erforderlich sein.
4. Nehmen Sie alle 5 Minuten Phasenkontrastbilder und alle 3 Stunden Fluoreszenzbilder auf, um die Phototoxizität zu verringern. Überprüfen und justieren Sie den Fokus in den ersten 3 Stunden des Experiments, da er sich ändern kann, während sich die Temperatur ausgleicht. Überprüfen und passen Sie den Fokus täglich an.
   HINWEIS: Wir beobachten, dass der Fokus nach den ersten 24 Stunden stabil wird. Es ist jedoch ratsam, den Fokus zu überwachen. Alternativ können Sie ein softwarebasiertes Autofokussystem verwenden.
5. Stoppen Sie die Erfassung nach 7 Tagen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zürich
Zellbeobachter-Mikroskop	Zeiss
Die Tracking Tool (tTt)-Software		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html