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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Fluoreszenzfärbung lebender Interneuronen
1. Übertragen Sie Kleinhirnschnitte mit einer Pasteur-Pipette mit breitem Durchmesser und Glasstumpf auf eine 6-Well-Platte (max. 3 Scheiben/pro Well). Aspirieren Sie das Medium der ausgewogenen Salzlösung (HBSS) von Hanks.
2. Inkubieren Sie die Scheiben (max. 3) in 5 ml Ladelösung des Fluoreszenzfarbstoffs (10 μM).
3. Zum Schutz vor Licht decken Sie die Mikroplatte mit Alufolie ab. Legen Sie es für 10 Minuten bei RT bei 35 U/min auf einen Kreiseltisch, um die Zellmarkierung zu erleichtern.
4. Transfer von Scheiben auf die Membran eines Transwell-Einsatzes (3,0 μm Porengröße; Abbildung 1D) mit einer Pasteur-Pipette mit breitem Loch aus Glas. Das Lademedium mit einer Pipette ansaugen.
5. Entfernen Sie den Einsatz und füllen Sie die Vertiefung mit 1,9 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Setzen Sie den Einsatz wieder ein und geben Sie 100 μl DMEM auf die Scheibe, um das Gewebe zu bedecken.
6. Die Platte mit den Kultureinsätzen für 2 Stunden in die Inkubatorkammer (37 °C, 5 % CO2) stellen, was ausreicht, um Körnerzellen (GCs) in der Molekülschicht (ML) zu beobachten. Legen Sie das Gewebe flach, um eine Befestigung an der Einsteckmembran zu ermöglichen (Abbildung 1E). Stellen Sie sicher, dass die Scheiben nicht trocknen.
2. Ex vivo Bildgebung durch konfokale Makroskopie
1. Übertragen Sie die Platte ohne Kunststoffdeckel in einen Inkubator, der am Stativ eines konfokalen Makroskops befestigt ist. Setzen Sie eine Glasabdeckung auf den Platteneinsatz des Makroskops. Halten Sie die Temperatur der Kammer bei 37,0 °C ± 0,5 °C und führen Sie die Scheiben mit konstantem Gasfluss (95% O2, 5% CO2) durch den Platteneinsatz zu, um den pH-Wert konstant zu halten. Warten Sie weitere 2 Stunden, bevor Sie das Zeitrafferexperiment durchführen.
2. Um die GC-Migration in den Gewebeschnitten sichtbar zu machen, beleuchten Sie das Präparat mit einem Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm mittels einer Laserdiode durch ein konfokales Laserscanning-Makroskop, das mit einem X2-Trockenobjektiv ausgestattet ist (Arbeitsabstand: 39 mm, Durchmesser: 58 mm, NA = 0,234), und detektieren Sie die Fluoreszenzemission von 500 bis 530 nm.
1. Um die Bewegung der GCs fein aufzulösen, nehmen Sie Bilder mit einem zusätzlichen optischen Zoomfaktor von 1,5 bis 2,0 auf. Erfassen Sie Bilder von GCs in einer einzelnen Fokusebene oder in bis zu 10 verschiedenen Fokusebenen entlang der z-Achse alle 30 Minuten für bis zu 12 Stunden.
3. Entfernen Sie bei Bedarf die Glasabdeckung und fügen Sie kleine Mengen (1-10 μl) biologischer Aktivatoren oder Inhibitoren in DMEM mit einer 10-μl-Pipette hinzu, um deren Wirkung auf die GC-Migration zu untersuchen.
3. Zellverfolgung
1. Führen Sie für jede Zeit des Films eine Z-Stapel-Projektion über den ecart-Modus in ImageJ durch. Modulieren Sie den Kontrast und die Helligkeit der aufeinanderfolgenden Bilder, um die Identifizierung und Verfolgung der beschrifteten GCs zu erleichtern. Ordnen Sie jede Position auf dem Referenz-Schnappschuss manuell zu (bei t = 0).
1. Verwenden Sie das Plugin "Manuelles Tracking" im Menü "Partikel analysieren" und bestimmen Sie durch Klicken den Schwerpunkt jedes Zellkörpers während des Zeitraffers. Exportieren Sie die Tracking-Rohdaten in eine Tabelle.
2. Reorganisieren Sie die exportierten Tracking-Rohdaten von ImageJ mit einem Smart-Home-Programm, das jede Zelle und die zugehörigen Positionen identifiziert. Berechnen Sie mit dem Programm die gesamte zurückgelegte Strecke und die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit für jede Zelle. Klassifizieren und vergleichen Sie die Merkmale der Zellmigration unter Kontroll- und Behandlungsbedingungen unter geeigneten Filtern mit demselben Programm.
