Zeitraffer-Bildgebung der neuralen Stammzellteilung von Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Daynac, M., et. al. Zellsortierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone adulter Mäuse und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklusdynamik. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Zeitraffer-Bildgebung von neuralen Stammzellen (NSCs) aus einem transgenen Mausgehirn unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops. NSCs fluoreszieren während der G1-Phase rot und sind in anderen Zellzyklusphasen nicht fluoreszierend. Eine adhärente NSC-Kultur wird in die Bildgebungskammer gelegt, die Bildgebungsparameter werden eingestellt und die Bilder werden in regelmäßigen Abständen für die gewünschte Dauer aufgenommen.

Protokoll

1. Grundlegende Einrichtung vor der Kultur- und Videomikroskopie

1. Verwenden Sie Kulturplatten mit Glasboden oder μ-Platten für die konfokale Videomikroskopie. Verwenden Sie für 1 - 5 x 10³ Zellen/Vertiefung 96-Well-Platten, und für mehr als 5 x 10³ Zellen/Vertiefung verwenden Sie 24-Well-Platten.
2. Bereiten Sie mindestens einen Tag vor Beginn des Versuchs sterile Poly-D-Lysin (PDL)-beschichtete Platten für adhärente Monolayer-Kulturen vor. Geben Sie genügend PDL (10 μg/ml in destilliertem Wasser oder dH₂O) zu, um den Boden jeder Vertiefung zu beschichten, und inkubieren Sie sie über Nacht (O/N) bei 37 °C. Entfernen Sie die PDL-Lösung und spülen Sie sie dreimal mit dH₂O ab, bevor Sie die Platte mindestens 2 Stunden lang in der Haube unter laminarer Strömung trocknen lassen. Wenn die beschichtete Platte nicht sofort verwendet wird, lagern Sie sie bei -20 °C.
3. Nährmedium durch Mischen des Basalmediums für neurale Stammzellen (NSC) und NSC-Proliferationszusatz im Verhältnis 9:1 (siehe Materialtabelle) zusammen mit 2 μg/ml Heparin, 20 ng/ml gereinigtem humanen rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und 10 ng/ml humaner rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2). Erwärmen Sie das Nährmedium vor der Verwendung in einem Wasserbad auf 37 °C.
4. Für die Dissoziation der subventrikulären Zone (SVZ) bereiten Sie Papainlösung vor: 1 mg/ml Papain (15 IE/ml) in Earl's Balance Salt Solution (EBSS) mit 0,2 mg/ml L-Cystein, 0,2 mg/ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,01 mg/ml DNase I in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. Die Lösung vor Gebrauch bei 37 °C äquilibrieren.
5. Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, bereiten Sie eine Proteasehemmerlösung (Ovomucoid) vor: Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM):F12-Medium mit 0,7 mg/ml Trypsin-Inhibitor Typ II. Filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,2 μm Filter.
6. Bereiten Sie PBS 0,6% ige Glukoselösung zur Entnahme des Gehirns und PBS 0,15% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung zum Waschen der Schritte und zur Antikörperfärbung vor.
7. Bereiten Sie Sezierwerkzeuge vor: eine Schere, eine Präparier- und Bindezange und ein Skalpell. Weichen Sie sie in 70% Ethanol ein.

2. Entnahme von adulten Mausgehirnen und SVZ-Mikrodissektionen

1. adulte Mäuse mit Fluoreszenz-Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) (2 bis 3 Monate alt und/oder 12 Monate alt für Alterungsstudien) unter Durchführung einer Gebärmutterhalsdislokation in Übereinstimmung mit den entsprechenden institutionellen Richtlinien.
2. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol und schneiden Sie den Kopf mit einer scharfen Schere ab.
3. Machen Sie einen Schnitt entlang der Kopfhaut, um den Schädel freizulegen.
4. Führen Sie mit einer kleinen Schere einen Längsschnitt in der Mittellinie durch, der an der Schädelbasis in Richtung der Riechkolben beginnt. Achten Sie darauf, das darunter liegende Gehirn nicht mit den Scherenklingen zu beschädigen. Entferne den oberen offenen Teil des Schädels mit einer gebogenen Pinzette, um das Gehirn freizulegen.
5. Sammeln Sie das Gehirn in einer 15-mm-Petrischale, die 0,6 % Glukose in PBS enthält.
6. Sezieren Sie die Riechkolben weg. Legen Sie das Gehirn auf seine dorsale Oberfläche und machen Sie mit einem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das Chiasma opticum.
7. Positionieren Sie unter einem Präpariermikroskop den rostralen Teil des Gehirnabschnitts mit der geschnittenen koronalen Oberfläche nach oben in Richtung des Experimentators.
8. Um die SVZ zu präparieren, entfernen Sie das Septum mit einer feinen gekrümmten Pinzette, führen Sie dann eine Spitze einer feinen Pinzette in das Striatum unmittelbar neben dem Ventrikel ein und lösen Sie die SVZ vom umgebenden Gewebe. Geben Sie das präparierte SVZ in eine Petrischale, die 1 ml PBS-0,6% Glukose enthält.

3. SVZ-Gewebedissoziation

1. Zerkleinern Sie das sezierte SVZ in der Petrischale, bis keine großen Stücke mehr übrig sind.
2. Das zerkleinerte Gewebe zusammen mit der PBS-0,6%igen Glukose in ein 15-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren.
3. Den Überstand verwerfen und 1 ml vorgewärmtes Papain (1 mg/ml, zubereitet in Schritt 1.4) mit 0,01 mg/ml DNase I hinzufügen. 10 Minuten in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. 1 ml Papain pro Maus verwenden.
4. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
5. 1 ml vorgewärmtes Ovomucoid (0,7 mg/ml, zubereitet in Schritt 1.5) zugeben, um die Papainaktivität zu stoppen. Dissoziieren Sie das zerkleinerte Gewebe mechanisch weiter in eine einzellige Suspension, indem Sie vorsichtig 20 Mal durch eine p1000-Mikropipettenspitze auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie Luftblasen.
6. Die Zellsuspension wird in einem neuen 15-ml-Röhrchen durch einen sterilen 20-μm-Filter geleitet. Achten Sie darauf, den Zellenfilter mit PBS 0,15 % BSA zu waschen, um einen Zellverlust zu vermeiden.
7. Bei 200 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl PBS mit 0,15 % BSA.

4. Immunfluoreszenzfärbung für die Zellsortierung

Für die Zellsortierung mit FUCCI-Red-Mäusen (Abbildung 1A) werden die folgenden Antikörper verwendet: CD24-Phycoerythrin-Cyanin-7-Konjugat [PC7]; CD15/LeX-Fluorescein-Isothiocyanat [FITC]-konjugierter und Ax647-konjugierter EGF-Ligand.

Hinweis: LeX⁺EGFR⁺ Zellen und EGFR⁺ Zellen sind in der adulten SVZ nicht reichlich vorhanden: ≈ 600 bzw. 1500 Zellen/Maus. Wir empfehlen, SVZ-Zellen von 2 bis 3 Mäusen zu poolen, um genügend Material zu haben. Arbeiten Sie nicht mit mehr als 12 Mäusen am selben Tag, damit die Zellsortierdauer 3 Stunden nicht überschreitet. Denken Sie daran, dass die Arbeit mit zu vielen Mäusen am selben Tag zu einer verlängerten Zellsortierdauer führt, was möglicherweise zu einem erhöhten Zelltod und/oder einer erhöhten Zelldifferenzierung führt.

1. Führen Sie die FACS-Färbung in 100 μl PBS 0,15 % BSA pro Maus durch (oder in 200 μl für eine Gruppe von 2 bis 3 Mäusen für eine optimale Färbung).
2. Bereiten Sie die Steuerrohre vor. Verwenden Sie Kompensationsperlen, um einfarbige Kontrollröhrchen gemäß dem Protokoll des Herstellers herzustellen. Wählen Sie eine Fraktion von Zellen aus (1/10 der aus einer Maus extrahierten Zellen ist ausreichend) und trennen Sie sie in 4 Röhrchen, um 1 negatives Kontrollröhrchen (unmarkierte Zellen) und 3 Fluoreszenz-minus eins (FMO) Kontrollröhrchen herzustellen. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl PBS 0,15 % BSA pro Röhrchen.
   Hinweis: Für die LeX-FITC FMO-Kontrolle markieren Sie die Zellen mit CD24-PC7 (1:50) und Ax647-konjugiertem EGF-Liganden (1:200); Für die CD24-PC7-FMO-Kontrolle markieren Sie die Zellen mit CD15/LeX-FITC (1:50) und Ax647-konjugierten EGF-Liganden (1:200) und für die Ax647-konjugierte EGF-Liganden-FMO-Kontrolle markieren Sie die Zellen mit CD15/LeX-FITC (1:50) und CD24-PC7 (1:50).
3. Für die Röhrchen, die für die Zellsortierung verwendet werden, verwenden Sie die folgenden Antikörper in der angegebenen Verdünnung in PBS 0,15 % BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) und Ax647-konjugierter EGF-Ligand (1:200).
4. 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. Mit 1 ml PBS 0,15% BSA waschen und bei 200 x g 10 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl PBS 0,15% BSA pro Gehirn. Halten Sie die Zellsortierröhrchen auf Eis und fahren Sie sofort mit der Zellsortierung fort.
5. Bei Verwendung von FUCCI-Green-Mäusen trennen Sie vor der Zellsortierung LeX-positive und LeX-negative Fraktionen mit Trennsäulen, da der LeX-FITC-Antikörper die gleiche Emissionswellenlänge wie die FUCCI-grüne Fluoreszenz hat (Abbildung 2A, B).
   1. Zuerst werden die Zellen 15 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln in 100 μl PBS 0,15 % BSA mit einem Maus-Anti-Human-LeX-Antikörper (1:50) markiert.
   2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS 0,15 % BSA und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 200 x g, dann markieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln mit Anti-Maus-IgM-Mikrokügelchen (1:10).
   3. Die Zellen mit 1 ml PBS 0,15% BSA waschen und bei 200 x g 10 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl PBS 0,15 % BSA und gießen Sie die Zellen durch die Trennsäule im Magnetfeld, wie in Abbildung 2C schematisiert. Waschen Sie die Säule mit 1 ml PBS 0,15 % BSA, um eine negative LeX-Fraktion zu erhalten.
   4. Um eine LeX-positive Fraktion zu erhalten, nehmen Sie die Trennsäule aus dem Magnetfeld und eluieren Sie die Zellen mit 2 ml PBS 0,15% BSA.
   5. Fahren Sie mit der Färbung von CD24-PC7 und Ax647-konjugierten EGF-Liganden fort, wie in 4.2 gezeigt.

5. Zellsortierung

Hinweis: Die Zellen wurden auf einem FACS-Sortierer bei 40 Psi mit einer 86-μm-Düse sortiert. Die Fluoreszenz wurde mit dem folgenden Filterset erfasst: 520/35 nm (FITC), 575/26 nm (PE), 670/20 nm (Ax647) und 740LP (PC7). Eine Kompensation ist notwendig, um falsch-positive Signale zu vermeiden, da sich die Emissionsspektren der FUCCI-Rotfluoreszenz und des PC7-Farbstoffs überlappen.

1. Unmittelbar vor der Zellsortierung fügen Sie einen lebenswichtigen Farbstoff hinzu, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden. Wir haben Hoechst (HO) (siehe Materialtabelle) in einer Endkonzentration von 2 μg/ml verwendet. Führen Sie das negative Kontrollrohr (unmarkierte Zellen) durch den FACS-Sortierer und wählen Sie die Zellen mit den Parametern Seitenstreuung (SSC) und Vorwärtsstreuung (FSC) aus (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Tote Zellen wurden ausgeschlossen, indem nur der HO-negative Anteil gegated wurde (Abbildung 3A), und dann wurden Dubletten durch Auswahl des negativen Pulsbreitenanteils ausgeschlossen (Abbildung 3A).
2. Führen Sie die in Schritt 4.2 vorbereiteten einfarbigen Regler aus und passen Sie die Spannungen der Photomultiplier-Röhre (PMT) bei Bedarf an (z. B. negative Population zu hoch und/oder positive Zellen außerhalb der Skala). Führen Sie die Farbkorrektur im Kompensationsfenster der Software durch.
3. Führen Sie die in Schritt 4.2 vorbereiteten FMO-Kontrollen (LeX-FITC FMO-Steuerung, CD24-PC7 FMO-Steuerung und Ax647-konjugierte EGF-Liganden-FMO-Steuerung) aus und zeichnen Sie die Sortiergatter (Abbildung 3). Sortieren Sie die Zellen direkt in 100 μl Kulturmedium in 1,5 ml Mikroröhrchen.

6. Vorbereitung der Zellen für die Mikroskopie

1. Die frisch sortierten Zellen mit einer Dichte von 1 - 3 x 10³ Zellen/Well auf Poly-D-Lysin-beschichteter 96-Well-μ-Platte mit 300 μl Kulturmedium plädieren.
2. Vor der Videomikroskopie die Kulturplatten mindestens 1 Stunde lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.

7. Einrichtung des Mikroskops und Bildaufnahme

1. Live-Bildgebung mit einem Plan Apo VC 20x DIC-Objektiv (NA: 0,75) auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopsystem, das an einer invertierten thermostatisierten Kammer bei 37 °C unter einer Atmosphäre von 5 % CO₂ befestigt ist.
2. Positionieren Sie die 96-Well-μ-Platte in der vorgewärmten und äquilibrierten Thermostatkammer und ersetzen Sie den Deckel durch eine thermostatisierte Abdeckung.
3. Öffnen Sie die NIS-Elements Software und klicken Sie in der Menüleiste auf "Acquire/Acquisition controls/ND acquisition", um die Optionen des Zeitraffers (Länge, Tischpositionen, konfokale Z-Schnitte,...), "Acquire/Acquisition-Regler/Ti Pad" zur Auswahl der Objektive und "Acquire/Acquisition-Regler/A1plus Settings" zur Auswahl des PMT-Pegels für jede Fluoreszenz in der Menüleiste auszuwählen. Wählen Sie einen Ordner aus, in dem die Datendateien gespeichert werden sollen.
4. Legen Sie im ND-Aufnahmefenster die Mitte jedes Wells als Tischposition fest und wählen Sie die Option "Großes Bild" auf 7 x 7 mm². Dadurch wird ein Mosaikbild um die Mitte jeder Vertiefung erstellt. Legen Sie die Überlappung für das große Mosaikbild auf 5 % fest. Machen Sie 24 Stunden lang alle 20 Minuten Fotos. Wählen Sie im Ti Pad-Fenster das Plan Apo VC 20x DIC-Ziel (NA: 0,75) aus.
5. Im A1plus-Einstellungsfenster können Sie Bilder mit einem Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanner im Format 512 x 512 Pixel und einer Auflösung von 1,26 μm/Pixel aufnehmen. Verwenden Sie Hellfeld, um Zellenformen zu visualisieren. Im Falle von FUCCI-Red-Mäusen regen Sie die rote Fluoreszenz bei 561 nm an und sammeln Sie sie mit einem 595/50 nm-Filter. Im Falle von FUCCI-Green-Mäusen regen Sie die grüne Fluoreszenz bei 488 nm an und sammeln Sie sie mit einem 530/40 nm-Filter. Bestimmen Sie den optimalen PMT-Pegel, den Offset und die Laserleistung für jede Wellenlänge.
   HINWEIS: Wir empfehlen, die Autofokus-Funktion für den Hellfeldkanal zu verwenden, damit die Software vor jeder Aufnahme an jeder Tischposition automatisch fokussieren kann. Tipp: Es wurde ein Plan Apo VC 20x DIC Objektiv (NA: 0,75) verwendet, das aufgrund seiner hervorragenden Auflösung ohne den Einsatz von Öl auskommt. Je nach gewünschter optischer Auflösung können auch andere Objektive verwendet werden.
6. Wählen Sie die Schaltfläche "Jetzt ausführen" im ND-Erfassungsfenster, um die Erfassung zu starten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Live-Analysen des Zellzyklus mit FUCCI-Red-Mäusen. (A) Schematische Darstellung des FUCCI-Rot-Zellzyklus, bei dem die Zellen während des G-Zyklus rot fluoreszieren.₁ Phase und farblos während der S-G₂/M-Pha...

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