Mikroendoskopische Calcium-Bildgebung in Echtzeit in einer frei beweglichen Maus

Zusammenfassung

Quelle: Lee, H. et. al., Erfolgreiche In vivo Calcium-Bildgebung mit einem miniaturisierten Head-Mount-Mikroskop in der Amygdala einer sich frei verhaltenden Maus. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die In-vivo-Kalziumbildgebung bei einer Maus unter Verwendung einer GRIN-Linse (Gradient Refractive Index) und eines miniaturisierten Mikroskops. Der Aufbau kombiniert die Fixierung des Kopfes in einem reibungslosen mobilen Käfigsystem, stimuliert Neuronen und löst den Einstrom von Kalziumionen aus. Die GRIN-Linse erfasst die Kalziumsignalisierung im Gehirn und ermöglicht so eine Echtzeit-Visualisierung der neuronalen Aktivität.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus sechs Hauptschritten: Virusinjektionsoperation, GRIN-Implantatchirurgie (Gradient Refractive Index), Validierung der GRIN-Linsenimplantation, Anbringung der Basisplatte, optische Aufzeichnung des GCaMP-Signals (Fusion von grün fluoreszierendem Protein (GFP), Calmodulin (CaM) und M13, einer Peptidsequenz aus der Myosin-Leichtkettenkinase) während eines Verhaltenstests und Datenverarbeitung (Abbildung 1A). Außer für die Chirurgie wird das kommerzielle Softwarepaket (Inscopix) verwendet.

1. Stereotaktische Chirurgie – Injektion von Adeno-assoziierten Viren (AAV)
HINWEIS: Der bei diesem chirurgischen Eingriff verwendete Mausstamm ist C57BL6/J. Der Körper des Tieres wird während der Operation mit einem sterilen Tuch bedeckt, und alle Schritte des Protokolls werden mit sterilen Handschuhen durchgeführt. Mehrere Operationen werden in der Regel nicht am selben Tag durchgeführt. Wenn jedoch mehrere Mäuse am selben Tag die gleiche Operation durchführen müssen, verwenden Sie für jede Maus einen separaten Satz autoklavierter chirurgischer Instrumente und 70 % Ethanol, um die chirurgischen Instrumente zwischen den Mäusen zu desinfizieren. Um die Maus während des chirurgischen Eingriffs warm zu halten, wird die Maus mit einer speziell angefertigten OP-Decke bedeckt, nachdem sie auf dem stereotaktischen Rahmen fixiert wurde.

1. Desinfizieren Sie alle erforderlichen chirurgischen Instrumente mit 70 % Ethanol und bereiten Sie eine Hamilton-Spritze und eine Glaspipette vor. Füllen Sie die Glaspipette mit destilliertem Wasser.
   HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente, die im Protokoll verwendet werden, sind autoklaviert. Da die GRIN-Linse und die Schädelschrauben für die Sterilisation nicht autoklaviert werden können, wird 70%iges Ethanol als Desinfektionsmittel verwendet, um Entzündungen vorzubeugen. Obwohl nicht ausprobiert, können andere Formen der Sterilisation verwendet werden, z. B. Gas- oder chemische Sterilisation.
2. Betäuben Sie die Maus mit Pentobarbital (83 mg∙kg-1 Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion. Nachdem die Maus bewusstlos geworden ist, rasieren Sie das Fell auf dem Schädel.
3. Reinigen Sie die Haut über dem Schädel mit 70% Ethanol und fixieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und wischen Sie die Schädeloberfläche mit einer 35%igen Wasserstoffperoxidlösung mit einem Wattestäbchenapplikator ab. Tragen Sie eine Gleitmittel-Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Operation zu verhindern.
   HINWEIS: Obwohl es normalerweise kein Problem ist, 70%iges Ethanol nur für die aseptische Hautvorbereitung zu verwenden, wird empfohlen, 3 abwechselnde Runden Desinfektionsmittel zu verwenden, z. B. Jodophore oder Chlorhexidinlösung, und 70% Ethanol. In diesem Protokoll wird eine höhere Konzentration an Wasserstoffperoxid verwendet, um sicherzustellen, dass das Bindegewebe am Schädel der Maus so vollständig wie möglich entfernt wird, was für die Reduzierung von Bewegungsartefakten bei der späteren Bildgebung entscheidend ist, da das Bindegewebe am Schädel eine feste Befestigung der Basisplatte am Schädel stört. Es ist zu beachten, dass 35 % Wasserstoffperoxid viel höher sind als das, was normalerweise verwendet wird (3 %).
4. Befestigen Sie den Stift mit einem stereotaktischen Sondenhalter. Richten Sie die Höhe von Bregma und Lambda an der Stecknadel aus.
5. Finden Sie die spezifische Stelle am Schädel der Maus für die Kraniotomie.
   HINWEIS: Die Koordinaten der lateralen Amygdala (LA) für die Virusinjektion sind (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) vom Bregma in diesem Protokoll (AP; Anterior-Posterior, ML; Medial-Lateral, DV; Dorsal-Ventral, jede Abkürzung gibt den relativen axialen Abstand vom Bregma an). Die Koordinaten sollten für jede Versuchsbedingung optimiert werden.
6. Bohren Sie die Schädeloberfläche (Abbildung 1B). Waschen Sie die Schädelfraktionen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die verbleibende Schicht mit einer Pinzette oder einer 27 G Nadel.
   1. Wenn du den Schädel bohrst, versuche, die letzte Dura-Schicht nicht zu berühren, um eine Beschädigung der Oberfläche des Gehirngewebes zu vermeiden. Eine beschädigte Gehirnoberfläche verursacht eine Entzündung um die Linse herum, die zu starken Bewegungsartefakten und einer hohen Autofluoreszenz während der Aufnahme führt. Die Kraniotomie beträgt 1,6 mm. Die Bohrdrehzahl beträgt 18.000 U/min und die Bohrkrone 0,6 mm.
7. Um die GRIN-Linse von der Oberfläche des Hirngewebes der gebohrten Stelle auf die Zielamygdalastelle abzusenken, berechnen Sie den als "Wert A" bezeichneten Abstand, indem Sie die DV-Differenz zwischen dem Bregma und der exponierten Hirnoberfläche von der DV-Koordinate der Linsenimplantation subtrahieren, die auf der Grundlage des Bregmas (in diesem Fall 4,2 mm, Abbildung 1C).
8. Laden Sie 3 μl Mineralöl und 0,7 μl der AAV-Viruslösung in die Glaspipette.
   HINWEIS: Mineralöl hilft bei der Trennung von Viruslösung und Wasser. 0,7 μl ist ein optimiertes Volumen für die LA-Virusinjektion, das die LA vollständig abdecken kann.
9. Entfernen Sie den Stift aus dem stereotaktischen Sondenhalter und befestigen Sie die Glaspipette daran.
10. Platzieren Sie die Glaspipette an der in Schritt 1.5 genannten Injektionsstelle. Führen Sie die Glaspipette in das Hirngewebe ein, nachdem die Blutung vollständig gestoppt wurde.
11. Verabreichen Sie das Virus durch eine Glaspipette mit einer Injektionspumpe.
    HINWEIS: Der Titer des Virus sollte höher als 1 x 1013 vg/ml sein, um eine ausreichende Anzahl von GCaMP-exprimierenden Zellen zu erhalten. Die Injektionsgeschwindigkeit beträgt 0,1 μL/min und diffundiert 10 Minuten lang. Wenn es zu Blutungen kommt, waschen Sie die Gehirnoberfläche mit PBS. Halten Sie die Gehirnoberfläche in diesem Schritt feucht.
12. Entfernen Sie nach Beendigung der Injektion die Glaspipette langsam.

2. Stereotaktische Chirurgie – GRIN-Linsenimplantation
HINWEIS: Die Implantation von GRIN-Linsen ist der wichtigste Schritt in diesem Protokoll. Da eine gleichbleibend langsame Geschwindigkeit der GRIN-Linsenbewegung für eine erfolgreiche GRIN-Linsenimplantation entscheidend ist, kann ein motorisierter Operationsarm nützlich sein. Der motorisierte Operationsarm ist ein stereotaktischer Manipulator, der von einer Computersoftware gesteuert wird. Obwohl in diesem Protokoll der motorisierte Arm verwendet wird, können auch andere Wege verwendet werden, solange sich die Linse während der Implantation gleichmäßig und langsam bewegt. Detaillierte Informationen zum Gerät finden Sie in der Materialtabelle.

1. Bohren Sie den Schädel, um zwei Schädelschrauben zu implantieren. Waschen Sie alle Schädelfraktionen mit PBS.
   HINWEIS: Um die Bewegungsartefakte in der späteren optischen Bildgebung zu reduzieren, sind mindestens zwei Schrauben erforderlich. Die beiden Schädelschrauben und die Implantatposition der GRIN-Linse bilden ein gleichseitiges Dreieck (Abbildung 1B). Die Größe des Kraniotomie sollte eng mit dem Durchmesser der Schraube übereinstimmen. Wenn es zu Blutungen kommt, waschen Sie die blutende Oberfläche mit PBS. Die Bohrdrehzahl beträgt 18.000 U/min und die Bohrkrone 0,6 mm.
2. Desinfizieren Sie die Schrauben mit 70% Ethanol, um Entzündungen vorzubeugen. Implantieren Sie die Schrauben so tief wie möglich.
   HINWEIS: Schrauben sollten ohne zusätzliche Adhäsion, wie z. B. Zement, fest fixiert werden.
3. Installieren Sie einen motorisierten Operationsarm auf dem stereotaktischen Rahmen. Schließen Sie die erforderliche Hardware an den Laptop an, auf dem die Steuerungssoftware installiert ist (Materialtabelle).
4. Bevor Sie die GRIN-Linse absenken, bereiten Sie sich darauf vor, eine Nadelspur mit einer 26-G-Nadel zu machen.
   HINWEIS: Die Nadelschiene ist eine Art Führungsschiene, die hilft, die relativ dicke GRIN-Linse in tiefe Hirnregionen wie die Amygdala zu implantieren, ohne eine starke Verzerrung der Gehirnstruktur entlang des Injektionswegs zu verursachen. Diese Führungsschiene wird als Nadelbahn bezeichnet, da sie durch ein Absenken- und Anhebungsverfahren einer relativ dünnen 26 G Nadel hergestellt wird.
5. Befestigen Sie den Kanülenhalter, um die Nadel stabil am stereotaktischen Rahmen zu halten.
6. Fassen Sie die 26-G-Nadel mit dem Kanülenhalter und berechnen Sie die Koordinaten der Einstichstelle der Nadel.
   HINWEIS: In diesem Protokoll liegen die Koordinaten der Einstichstelle 50 μm lateral von der Virusinjektionsstelle (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
7. Greifen Sie auf die Steuerungssoftware zu und bereiten Sie die Nadelposition vollständig vor.
   1. Starten Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie die Schaltfläche Neues Projekt starten, um die Steuerungssitzung zu starten.
      HINWEIS: In der Steuerungssitzung gibt es mehrere leere Felder und Menüschaltflächen. Die leeren Felder sind Eingabefelder für Koordinaten. Nach Eingabe der Koordinaten in die leeren Felder bewegt sich der motorisierte stereotaktische Arm durch Klicken auf die Schaltfläche Gehe zu. Die Taste "Gehe zu" verwandelt sich in eine STOP-Taste, wenn sich der stereotaktische Arm bewegt. Von mehreren Menüschaltflächen ist in diesem Protokoll nur die Werkzeugtaste erforderlich.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Werkzeug. Kalibrieren Sie die Steuerungssoftware, indem Sie auf die Menüschaltfläche Rahmen kalibrieren klicken. Die Kalibrierung ist der Prozess, bei dem die tatsächliche Position des Manipulators als Wert in der Stereodrive-Software eingestellt wird.
8. Positionieren Sie die Spitze der Nadel mit einem stereotaktischen Manipulator an der freiliegenden Gehirnoberfläche auf der Schädeloberfläche.
   HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Nadel wird über das Microdrive-Geschwindigkeitsmenü im Werkzeugmenü eingestellt. Die Standardgeschwindigkeit beträgt 3,0 mm/s. In diesem Schritt wird jedoch eine Geschwindigkeit von 0,5 mm/s empfohlen. Die Bewegung der Nadel wird über die Pfeiltasten gesteuert.
9. Fügen Sie 2-3 Tropfen PBS hinzu, um die Gehirnoberfläche feucht zu halten. Füllen Sie das leere Feld auf dem Computerbildschirm mit den entsprechenden DV-Koordinaten des LA aus. Ist die Hirnoberfläche trocken, behindert dies das Eindringen der Nadel in das Hirngewebe
.
10. Senken Sie die 26-G-Nadel ab, indem Sie auf die Taste "Gehe zu" klicken. Sie stoppt automatisch, wenn die Nadel die durch die DV-Koordinaten festgelegte Zielstelle erreicht. Die Geschwindigkeit der Nadel beträgt 100 μm/min. Wenn es zu Blutungen kommt, stoppen Sie die Nadel, indem Sie auf die STOP-Taste klicken, und waschen Sie die Gehirnoberfläche mit PBS. Halten Sie die Gehirnoberfläche in diesem Schritt feucht. Nachdem die Blutung gestoppt ist, beginnen Sie wieder mit dem Absenken.
11. Nachdem sich die Nadel nicht mehr bewegt, geben Sie 45,00 mm in das leere Feld auf dem Computerbildschirm ein.
    HINWEIS: 45,00 mm ist ein Wert der DV-Koordinate, mit dem die Nadel in die Ausgangsposition zurückkehrt.
12. Erhöhen Sie die Nadel, indem Sie auf die Schaltfläche Gehe zu klicken. Die Geschwindigkeit der Nadelbewegung beträgt 100-200 μm/min.
13. Nachdem sich die Nadel nicht mehr bewegt, entfernen Sie das PBS auf der Gehirnoberfläche. Deinstallieren Sie die Nadel und den Kanülenhalter vom stereotaktischen Rahmen. Der Experimentator kann die Nadel manuell stoppen, indem er bei Bedarf auf die STOP-Taste klickt.
14. Rüsten Sie den stereotaktischen Stab mit dem Objektivhalter aus. Setzen Sie das GRIN-Objektiv auf den Objektivhalter.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wird das GRIN-Objektiv verwendet, das für das Targeting des LA optimiert ist (0,6 mm Durchmesser, 7,3 mm Länge). Wenn der Objektivhalter nicht vorbereitet ist, können Sie alternativ einen Bulldog-Clip verwenden, um das GRIN-Objektiv zu greifen.
15. Desinfizieren Sie die Linse mit 70%igem Ethanol und befestigen Sie den stereotaktischen Stab an den stereotaktischen Rahmen.
16. Platzieren Sie die Spitze der GRIN-Linse an der dafür vorgesehenen Stelle auf der Schädeloberfläche (gleiche Methode wie in Schritt 2.8 beschrieben).
    HINWEIS: Die Koordinate der GRIN-Linse ist (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (Abbildung 1C). Die Linse sollte den Schädel nicht berühren, um Schäden an der Spitze zu vermeiden.
17. Berechnen Sie die DV-Koordinate, indem Sie den Absolutwert von "Wert A" von der DV-Koordinate der in Schritt 2.16 beschriebenen Linsenimplantation subtrahieren.
18. Tropfen Sie 2-3 Tropfen PBS auf die Gehirnoberfläche. Geben Sie 1000 μm für die Absenkung und 300 μm für die Anhebung der Linse in das leere Feld auf dem Computerbildschirm ein.
19. Wiederholen Sie das Absenken (1000 μm nach unten) und Anheben (300 μm nach oben) der GRIN-Linse, bis sie die Zielstelle erreicht. Dieses Auf- und Ab-Verfahren wird verwendet, um den Druck im Gehirngewebe zu lösen, der aufgrund des Absenkvorgangs der Linse erzeugt wird, der sonst zu einer Verzerrung der Gehirnstrukturen entlang des Implantationswegs führen kann.
    HINWEIS: Die Geschwindigkeit der GRIN-Linsenbewegung beträgt 100 μm/min. Auch wenn es zu Blutungen kommt, hören Sie nicht auf, die GRIN-Linse zu bewegen und waschen Sie die Gehirnoberfläche mit PBS. Halten Sie die Gehirnoberfläche in diesem Schritt feucht. Wenn die Gehirnoberfläche trocken ist, haftet das Hirngewebe an der Oberfläche der GRIN-Linse und führt zu einer Verzerrung der Gehirnstruktur.
20. Wenn die GRIN-Linse die Zielstelle erreicht, entfernen Sie PBS und tragen Sie den Zahnharzzement vorsichtig um die GRIN-Linse, die Schrauben und ihre Seitenwand auf (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Das Auftragen des Harzzementes auf den gesamten Schädel kann Bewegungsartefakte reduzieren. Im Gegenteil, wenn der Harzzement versehentlich die am Schädel befestigten Muskeln bedeckt, erhöht er die Bewegungsartefakte.
21. Nachdem der Zahnzement aus Harz ausgehärtet ist, zerlegen Sie die GRIN-Linse vom Linsenhalter und tragen Sie Acrylzement auf den gesamten Schädel auf (Abbildung 1D).
22. Um die Kopfplatte zu befestigen, demontieren Sie den Objektivhalter von der stereotaktischen Stange und befestigen Sie die Kopfplatte mit Klebebändern an der Spitze der Stange. Vergewissern Sie sich, dass die Kopfplatte horizontal ist.
    HINWEIS: Eine geneigte Kopfplatte führt zu einer geneigten Ansicht. Für die Befestigung des Mauskopfes im Käfigsystem des Wohnmobils (im Bereich der Grundplattenbefestigung) wird eine Kopfplatte benötigt. Wenn der Versuchsleiter das System nicht verwendet, überspringen Sie diesen Schritt (Schritt 2.22) und den folgenden Schritt 2.23.
23. Senken Sie den Stab langsam ab, bis sich die Kopfplatte oben an der Lensmanschette befindet. Senken Sie die Kopfplatte um weitere 1000 μm ab. Bewegen Sie die Kopfplatte für die implantierte GRIN-Linse so, dass sie sich am rechten Rand des Innenrings der Kopfplatte befindet.
    HINWEIS: Die Kopfplatte sollte tiefer als die Oberfläche der implantierten GRIN-Linse positioniert werden. Andernfalls kann das Mikroendoskop aufgrund des Acrylzementes nicht nah genug an die implantierte GRIN-Linse herankommen, um die Brennebene anzupassen.
24. Tragen Sie Acrylzement auf, um die Kopfplatte mit den Zementschichten zu verbinden (Abbildung 1D).
25. Bringen Sie eine Paraffinfolie auf der implantierten GRIN-Linsenoberfläche an, um die Linsenoberfläche vor Staub zu schützen. Tragen Sie dann eine ablösbare Epoxidbindung auf den Paraffinfilm auf, um den Paraffinfilm auf der Linsenoberfläche zu halten.
26. Injizieren Sie Carprofen, ein Analgetikum (0,5 mg/ml in PBS), und Dexamethason, ein entzündungshemmendes Medikament (0,02 mg/ml in PBS), in die Bauchhöhle der Maus.
    HINWEIS: Die Dosis des Arzneimittels hängt vom Körpergewicht ab: Carprofen (5 mg∙kg-1 Körpergewicht) und Dexamethason (0,2 mg∙kg-1 Körpergewicht). Sowohl Carprofen als auch Dexamethason werden nach der Operation und einmal täglich für 7 Tage nach der Operation verabreicht.
27. Mischen Sie 0,3 mg/ml Amoxicillin, ein Antibiotikum, in Käfigwasser, um das Medikament 1 Woche lang zu verabreichen.
28. Bringen Sie die Maus in den Heimkäfig zurück und warten Sie 5-8 Wochen für die Genesung und Virustransduktion.
    HINWEIS: Die Maus wird in einem vorgewärmten Käfig auf einer Heizdecke geborgen, bis die Maus aus der Narkose erwacht.

3. Validierung der GRIN-Linsenimplantation
HINWEIS: Die Validierung der GRIN-Linsenimplantation gibt Aufschluss darüber, ob die implantierte GRIN-Linse auf das Ziel der GCaMP-exprimierenden Zellen trifft. Basierend auf diesen Informationen spart der Experimentator Zeit bei zeitaufwändigen Prozessen wie dem Verhaltenstest und der Datenverarbeitung, indem er Tiere mit einer nicht zielgerichteten GRIN-Linsenimplantation ausschließt. Während des Validierungsvorgangs sollten Zellen mit GCaMP-Expression im Aufzeichnungssichtfeld fokussiert werden. In diesem Schritt kommt ein Wohnmobilkäfig zum Einsatz. Ein mobiler Heimkäfig ist ein spezielles, rundes Gerät, das es Mäusen mit festem Kopf ermöglicht, ihre Beine während der Validierung der GRIN-Linsenimplantation und der Befestigung der Basisplatte frei zu bewegen. Ein Lufthebetisch in dieser Vorrichtung, auf dem die Beine von Mäusen mit fixiertem Kopf platziert sind, ermöglicht eine solche freie Bewegung der Beine, obwohl der Kopf fixiert ist. Die Zellen im lateralen Kern der Amygdala sind in der Regel in einem ruhenden oder anästhesierten Zustand ruhig, so dass GCaMP-Fluoreszenzsignale unter diesen Bedingungen selten nachgewiesen werden, was es sehr schwierig, manchmal unmöglich macht, Zellen zu finden, die GCaMP während der Validierung der GRIN-Linsenimplantation und der Basisplattenbefestigung exprimieren. Die Bewegung der Beine erzeugt jedoch häufig GCaMP-Fluoreszenzsignale in den Zellen des lateralen Kerns der Amygdala und kann so bei der Ortung des Mikroskops helfen. Daher wird in diesem Protokoll der Wohnmobilkäfig verwendet.

1. Bauen Sie den stereotaktischen Manipulator in das Käfigsystem des Wohnmobils ein.
2. Betäuben Sie die Maus mit 1,5% Isoflurangas. Nachdem die Maus völlig bewusstlos ist, setzen Sie die Maus auf die Kopfstange des Käfigsystems für Wohnmobile.
3. Platzieren Sie den Carbon-Käfig unter der Maus. Schließen Sie den Carbonkäfig und schalten Sie den Luftstrom ein, damit sich der Käfig frei und ohne Reibung bewegen kann. Warten Sie einige Minuten, bis die Maus aktiv wird.
   HINWEIS: Die Geschwindigkeit des Luftstroms sollte für jede Versuchsbedingung optimiert werden (hier 100 l/min).
4. Entfernen Sie den Paraffinfilm und die Epoxidbindung auf der Oberfläche der implantierten GRIN-Linse und wischen Sie die Linsenoberfläche mit 70%igem Ethanol unter Verwendung von Linsenpapier ab.
5. Bereiten Sie die Datenerfassungssoftware (z. B. Inscopix) vor. Stellen Sie die Bildgebungsbedingungen ein.
   HINWEIS: Die Datenerfassungssoftware wird zur Steuerung des Mikroskops (Leistung der Leuchtdiode (LED), Objektivfokus usw.) und zur Datenspeicherung verwendet.
   1. Schalten Sie die Datenerfassungsbox ein und schließen Sie ein Mikroskop daran an. Schließen Sie es dann entweder direkt über ein Kabel oder über drahtloses Internet an einen Laptop an.
      HINWEIS: Die Datenerfassungssoftware wird in der zusätzlichen Hardware namens DAQ-Box (z. B. Inscopix) installiert. Durch den Anschluss der Datenerfassungsbox an den Laptop wird die Datenerfassungssoftware auf einem Laptop zugänglich.
   2. Greifen Sie über einen Internetbrowser auf die Datenerfassungssoftware zu (Firefox wird empfohlen).
   3. Legen Sie alle notwendigen Details (Datum, Maus-ID usw.) in der definierten Sitzung fest. Klicken Sie dann auf Speichern und fortfahren. Rufen Sie nach dem Speichern die Sitzung Ausführen auf.
   4. Stellen Sie in der Run Session die Bildgebungsbedingungen ein, z. B. Belichtungszeit, Verstärkung, elektronischer Fokus und Belichtungs-LED-Leistung.
      HINWEIS: Verstärkung und Belichtungs-LED-Leistung können je nach Laborbedingungen geändert werden. Der empfohlene Wert für den elektrischen Fokus liegt bei 500 und die Belichtungszeit bei 50 ms. Es gibt keine Einschränkungen für die Änderung der LED-Leistung und des Gains. Eine höhere Lichtintensität kann jedoch zu mehr Ausbleichen führen. Die Belichtungszeit der Aufnahme bestimmt die Bildrate der Videoaufnahme. Höhere Bildraten verringern die Signalintensität. Die Bildraten sollten für die für die Bildgebung verwendeten GECIs optimiert werden.
6. Um das Mikroskop an einem stereotaktischen Manipulator zu halten, befestigen Sie den stereotaktischen Stab mit einem Mikroskopgreifer an dem stereotaktischen Manipulator.
   HINWEIS: Der Greifer ist ein kleines Zubehör, das an der stereotaktischen Vorrichtung befestigt werden kann, um einen Mikroskopkörper zu halten, um ihn an der Zielstelle des Gehirns zu platzieren.
7. Fassen Sie das Mikroskop mit dem Mikroskopgreifer. Schalten Sie das an das Mikroskop angeschlossene LED-Licht ein und richten Sie das Mikroskop vertikal aus. Senken Sie das Mikroskop während der Bildbetrachtung ab, bis die Oberfläche der implantierten GRIN-Linse sichtbar ist.
8. Richten Sie die Mitte der implantierten GRIN-Linse mit der Mitte des Bildes aus.
   HINWEIS: In diesem Schritt kann die Validierung der GRIN-Linseimplantation durchgeführt werden (siehe Ergebnisabschnitt, Abbildung 2B, Abbildung 2D, Abbildung 2F).
9. Nehmen Sie ein Bild der implantierten GRIN-Linsenoberfläche auf (Klicken Sie auf die Schaltfläche Prt Sc auf der Tastatur). Das Bild der implantierten GRIN-Linsenoberfläche wird benötigt, um nicht-neuronale Komponenten bei der späteren Datenverarbeitung abzuwählen (Schritt 6.8).
10. Finden Sie die richtige Position des Mikroskops. Heben Sie die Objektivlinse des Mikroskops während der Bildbetrachtung langsam an, um nach Zellen mit GCaMP7b-Expression zu suchen.
    HINWEIS: Es kann erforderlich sein, die Verstärkung der Bildaufnahme oder die Belichtungs-LED-Leistung anzupassen. In diesem Schritt kann die Validierung der GRIN-Linsenimplantation durchgeführt werden (siehe Ergebnisabschnitt in Abbildung 2A, Abbildung 2C, Abbildung 2E).

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematischer Arbeitsablauf und Diagramme für die stereotaktische Chirurgie für die in vivo mikroendoskopische Calciumbildgebung in der LA. (A) Ein schematischer Ablauf der mikroendoskopischen Calcium-Bildgebung in vivo in der LA. (B) Ein mi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
26G Nadel	BD	302002	Chirurgie
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	Chirurgie
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	nach Maß		Chirurgie
Acryl-Zahnzement (Ortho-jet Acryl Rosa)	Lang	1334-pink	Chirurgie & Basisplattenbefestigung
Luftströmungsmanipulator	Neurotar	NTR000253-04	Basisplattenbefestigung
Amoxicillin	SIGMA	A8523-5G	Chirurgie
Kohlenstoffkäfig	Neurotar	180mm x 70mm	Basisplattenbefestigung
Carprofen	SIGMA	PHR1452-1G	Chirurgie
Datenverarbeitungssoftware	INSCOPIX	INSCOPIX Datenverarbeitungssoftware	Basisplattenbefestigung & Verhaltenstest
Dexamethason	SIGMA	D1756-500MG
Chirurgiebohrer	Seyang	marathon-4	Chirurgie
Bohrer Bohrer	ELA	US1/2, Shank104	Chirurgie
Glasnadel	WPI	PG10165-4	Chirurgie
GRIN-Linse (INSCOPIX Proview Linsensonde)	INSCOPIX	1050-002208
Chirurgie Hamilton Spritze	Hamilton	84875	Chirurgie
Kopfplatte	Neurotar	Modell 5	Chirurgie
Computer	Samsung	NT950XBV	Chirurgie
Linsenhalter, Stereotaktischer Stab (INSCOPIX proview Implantat-Kit)	INSCOPIX	1050-004223
Greifer für Chirurgiemikroskope	INSCOPIX	1050-002199	Grundplattenbefestigung
Mikroskop, Datenerfassungssoftware, Hardware	INSCOPIX	nVista 3.0	Befestigung der Grundplatte und Verhaltenstest
Mobiler Homecage	Neurotar	MHC V5	Grundplattenbefestigung
Beweglicher Arm	Neurostar	Kundenspezifische	Software
bewegliche Chirurgie	Neurostar	Customized	Surgery
Abnehmbare Epoxidbindung	WPI	Kwik-Cast	Chirurgie
Harzzement (Super-Bond)	Sun medical	Super bond C&B	Chirurgie
Schädelschraube	Stoelting	51457	Chirurgie
Stereotaktischer Rahmen	Stoelting	51600	Chirurgie
Stereotaktischer Manipulator	Stoelting	51600	Aufsatz für Grundplatte

Laptop für