Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Summary

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Abstract

Tissue Wohnsitz mesenchymalen Stammzellen (MSC) sind wichtige Regulatoren der Reparatur von Gewebe oder Regeneration, Fibrose, Entzündung, Angiogenese und Tumorbildung. Zusammen stellen diese Studien deuten darauf hin, dass Resident Lunge MSC eine Rolle spielen bei der Lungengewebe Homöostase, Verletzung und Reparatur während Erkrankungen wie Lungenfibrose (PF) und arterielle Hypertonie (PAH) übernommen. Hier beschreiben wir eine Technologie, um eine Bevölkerung von Resident Lunge MSC definieren. Die Definition dieser Population in vivo Lungengewebe mit einer der Marker zu definieren erleichtert die wiederholte Isolierung eines gut charakterisierten Stammzellen Bevölkerung mittels Durchflusszytometrie und das Studium einer bestimmten Zelltyp und Funktion.

Protocol

1. Lung Isolation

1. Sacrifice erwachsenen Mäusen (8-10 Wochen im Alter; 18-20 g; C57Bl6J) Mäuse mit einer Überdosis Isofluran durch Ausbluten mit sterilen Technik gefolgt. Profile variiert leicht zwischen den Stämmen.
2. Chirurgisch entfernen Sie die Membrane, öffnet den Brustraum durch Schneiden der Brustkorb seitlich auf jeder Seite der Maus. Spülen Sie das Blut aus der Lunge durch Perfusion der rechten Herzkammer vorsichtig mit 3-5mls von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Präparieren Sie die Lungenlappen Entfernen der Luftröhre und großen Bronchien und in eine Petrischale mit Hanks gefüllt Salzlösung (HBSS). Nach Sammlung aller Lungenlappen Pinzette verwendet, um Gewebe auf den Deckel der Schale statt. Das Gewebe wird dann in kleine Stücke mit Einweg-Skalpelle mit genügend Flüssigkeit, um sie feucht, aber nicht so sehr, dass sie und Schwimmer bewegen zerkleinert.
4. Zerlegen einen Hinterlauf eines der Mäuse und zu isolieren, das Knochenmark als eine Färbung verwenden, um das flo gesetztw-Zytometrie Tore. Stain des Knochenmarks (BM), wie oben beschrieben ^1.

2. Erstellung eines Single Cell Suspension aus Lungengewebe

1. ; In sterile HBSS gelöst 5mls vorgewärmtes 0,2% Worthington Collagenase Typ 2 (cat # LS004202 Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ): Jede Lunge wird durch die Verwendung eines optimierten Gewebe Gewicht zu Volumen-Verhältnis von 0,2 g verdaut. Die Mischung wird in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min ^2,3 getaucht.
2. Man reibt Probe gut, bis Lungengewebe verdauen fließt leicht durch ein 10ml-Pipette (ca. 10 Wiederholungen). Inkubieren für weitere 15 min bei 37 ° C zur Vervollständigung der Gewebe verdaut und sorgt für eine gleichmäßigere einzigen Zellsuspension.
3. Verdünnen Sie die Lunge Zellsuspension mit HBSS und verreiben mit einer 5ml Pipette, um restliches Gewebestücke zu zerstreuen.
4. Filter die Suspension mit einer 70μM Zelle Sieb, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Probe in Multipl aufgeteilt werdene konische Röhrchen an dieser Stelle auf eine Überlastung einer Zelle Sieb und die Zeit verringern.
5. Pellet die Zellsuspension für 10 min bei 1500 rpm und Dekantieren des Überstandes.
6. Resuspendieren Zellpellet vorsichtig mit Raumtemperatur RBC Lysispuffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) und inkubieren bei RT 5 min. Fügen Sie ein gleiches Volumen an HBSS dem Lysepuffer inaktiviert und Filtern der Zellsuspension mit einer 40 um Zellsieb zu Schutt und Zellaggregate zu entfernen.
7. Pipette 10 &mgr; l jeder Probe werden gefärbt und zählen Zellzahlen sowohl für die Lungen-und BM-Proben mit einer Zählkammer. Hinweis: Notieren Sie sich die Gesamtmenge der Zellen.
8. Pellet die einzigen Zellsuspension von Lungenzellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min.
9. Resuspendieren beide Lungen-und BM-Zellen bei 1x10 ⁶ Zellen / ml in vorgewärmten (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit hoher Glukose (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) mit 2% fetalem bovine Serum (FBS) und 10mm HEPES.
10. Bereiten Sie eine 1mg/ml Stammlösung von Hoechst 33342 Farbstoff (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) in Wasser und Filter sterilisieren ^1,4. Die Hoechst-Farbstoff kann als Aliquots bei -80 ° C gelagert werden
11. Add Hoescht 33342 Farbstoff zu einer Endkonzentration von 5μg/ml (a 200x Verdünnung einer 1mg/ml stock) zu den einzelnen Zell-Suspension.
12. Mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Inversion und inkubieren in 37 ° C Wasserbad für genau 90 Minuten.

3. Färbung und Vorbereitung der Lung Zellsuspension für Durchflusszytometrie

1. Nach 90 min alle Schritte mit Hoechst gefärbt Lungenzellen muss bei 4 ausgeführt werden ° C oder auf Eis zu färben Efflux zu verhindern. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min bei 4 ° C, und Zellen in eiskaltem Färbepuffer (PBS +2% FBS).
2. Die Zellen in einer Konzentration von nicht mehr als 1x10 ⁷

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Discussion

Wir haben eine Methode zunächst zur BM hämatopoetischen Zellen zu identifizieren, um eine spezifische Population von Resident Lunge MSC isolieren angepasst. Aufgrund der Reproduzierbarkeit der Isolierung dieser Zellen wurden dann auch MSC aus. Ihre Herkunft hat als Resident in der adulten Maus Lunge (im Gegensatz zu BM abgeleitet Gegensatz) und einer phänotypischen und molekularen Profil dokumentierten ² definiert. Die Fähigkeit, immer wieder zu isolieren diese charakterisiert Bevölkerung ermöglicht die weitere Erforschung der biologischen Bedeutung und Rolle der Lunge MSC während Gewebshomöostase und Krankheit. Die jüngste Definition dieser Population in vivo in beiden murinen und humanen Lungengewebe ermöglicht die Entwicklung einer therapeutischen Strategie bei der Rettung von körpereigenen Zellen der Lunge Reparatur während Verletzungen und Krankheiten zu erleichtern gerichtet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma	P-5368
Hanks Salzlösung (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0,2% Worthington Collagenase Typ 2	Worthington Biochemicals	LS004202
Rote Blutzellen Lysepuffer	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Hoechst 33342 Farbstoff	Sigma	B2261
CD45-APC	BD Pharmingen	559864
Propidiumiodid	Sigma	81845
a-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01	;
FBS	Invitrogen	16000-069
0,5% Trypsin / EDTA	CellGro	25 bis 053-Cl
Komplette MesenCult Medium	Stem Cell Technologies	05511
0,4% w / v Giemsa-Färbelösung	Sigma	GS1L
4% Paraformaldehyd	Electron Microscopy Dienstleistungen	15710	16% paraformeldehyde ist auf 4% mit PBS verdünnt
Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE)	Sigma	21888