Visualisierung eines Aderhautplexus des Mausgehirns mittels Rasterelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Van Wonterghem, E., et al. Mikrodissektion und Ganzmontage-Rasterelektronenmikroskopie: Visualisierung des Aderhautplexus der Maus. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Präparation und Bildgebung von Aderhautplexusgewebe aus einem Mäusegehirn mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM). Der Prozess umfasst die Fixierung des Gewebes, die Dehydrierung und die Beschichtung mit einer leitfähigen Platinschicht, um die Probe zu stabilisieren und für die Bildgebung vorzubereiten. Das REM nimmt detaillierte Bilder von Epithelzellen mit Mikrovilli auf und gibt so Einblicke in die strukturellen Merkmale des Gewebes.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Morphologische Analyse des Gewebes des Plexus choroideus (CP) mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM)

ACHTUNG: In den folgenden Verarbeitungsschritten werden giftige Lösungen verwendet. Es wird empfohlen, die Probenvorbereitung in einem Abzug durchzuführen.

1. Führen Sie die Probenvorbereitung für das REM wie unten beschrieben durch.
   1. Das frisch isolierte CP wird in eine frisch hergestellte Fixierlösung überführt, die 2 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,4) enthält. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      HINWEIS: Da das CP-Gewebe sehr zerbrechlich und dünn ist, sollte das Gewebe in kleine Probenkörbe gelegt werden (siehe Tabelle der Materialien), um es zwischen den Puffern zu übertragen. Auf diese Weise bleibt die Struktur des Gewebes besser erhalten. Ein Fixiermittel auf Cacodylatbasis wird gegenüber einem auf Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) basierenden Fixativ verwendet, da der starke Cacodylatpuffer dem niedrigen pH-Wert von Glutaraldehyd im EM-Fixativ entgegenwirken kann.
   2. Waschen Sie die Probe 3x für jeweils 5 min mit 3-5 mL 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,4).
   3. Die Proben werden 30 Minuten lang in 3-5 ml 2%igem Osmiumtetroxid in 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer fixiert. Waschen Sie die Proben 3x für jeweils 5 min mit 3-5 mL Reinstwasser.
   4. Die Proben werden in einer Reihe von eiskalten Lösungen mit steigenden Ethanol (EtOH)-Konzentrationen (50 %, 70 %, 85 %, 100 %) für 15 Minuten pro EtOH-Lösung dehydriert. Verwenden Sie einen Trockner an kritischen Punkten, um die Probe richtig zu trocknen. HINWEIS: Der Wechsel von der flüssigen zur gasförmigen Phase beeinflusst die Oberflächenspannung und führt zu einer Beschädigung der Oberflächenstruktur. Der kritische Punkttrocknungsschritt ermöglicht die Erhaltung der Oberflächenstruktur.
   5. Positionieren Sie die Probe vorsichtig auf einer Probenhalterung, die mit einem Kohleaufkleber versehen ist (siehe Tabelle der Materialien).
   6. Beschichten Sie die Proben mit einer dünnen Schicht (2-5 nm) Platin. Montieren Sie dazu eine Platinquelle in einem Vakuumsystem zwischen zwei elektrischen Hochstromanschlüssen und erhitzen Sie das Platin auf seine Verdampfungstemperatur. Ein feiner Platinstrahl lagert sich auf der Probe ab. HINWEIS: Neben Platin kann auch Gold oder Gold/Palladium verwendet werden.
2. Visualisieren Sie die CP-Proben mit REM (siehe Tabelle der Materialien). Das Visualisierungsverfahren von CP-Gewebe über REM ist ähnlich wie bei anderen Gewebetypen und hängt von der verwendeten Software und den Instrumenten ab.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aluminium-Probenhalterungen	EM Sciences	75220
Cacodylatpuffer	EM Sciences	11652
Carbon-Klebelaschen -12 mm	EM Sciences	77825-12
Kritischer Punkttrockner	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		REM System
Pinzette	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehyd	EM Sciences	16220
Osmium Tetroxide	EM Sciences	19170
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS ohne Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ oder Phenolrot; steril gefiltert
Probenkorb Edelstahl	EM Sciences	70190-01