Fluoreszenzbildgebung der synaptischen Calciumdynamik in einem in vitro Modell der Amyotrophen Lateralsklerose

Zusammenfassung

Quelle: Krishnamurthy, K. et al. Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt Echtzeit-Kalziumbildgebung zur Überwachung der synaptischen Aktivität in ALS-mutierten Neuronen, die einen genetisch kodierten Kalzium-Biosensor exprimieren. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Neuronen für die Bildgebung, zur Stimulierung der Kalziumdynamik und zur Aufzeichnung der Fluoreszenz, um Echtzeitänderungen des intrazellulären Kalziumspiegels zu messen, die die neuronale synaptische Aktivität widerspiegeln.

Protokoll

1. Fluoreszenzbildgebung von Gcamp6m-Kalziumtransienten

1. Transfizieren Sie primäre kortikale Nagetierneuronen, die auf 35-mm-Glasbodenschalen mit 500 ng Gcamp6m kultiviert wurden.
   HINWEIS: Falls gewünscht, co-transfizieren Sie Neuronen mit einem Plasmid von Interesse, das ein Fluoreszenz-Tag im roten oder dunkelroten Bereich enthält.
2. Inkubieren Sie Neuronen mit künstlichem Liquor (aCSF) mit niedrigem Kaliumchlorid (KCl) (Tabelle 1) für 15 Minuten, 48 Stunden nach der Transfektion, und montieren Sie dann die Schale auf der Bildgebungsplattform.
3. Visualisieren Sie die GCaMP6m-Fluoreszenz mit einem Fluorescein-Isothiocyanat-Filter (FITC) (488 nm) und einem 20x- oder 40x-Objektiv.
4. Wählen Sie das Bildfeld aus und stellen Sie den perfekten Fokus ein. Nehmen Sie als Nächstes ein einzelnes Standbild mit Hellfeld-, FITC- und Fluoreszenzmarkerkanälen auf, um neuronale Grenzen zu markieren.
5. Initiieren Sie "Jetzt ausführen" in der Erfassungssoftware. Führen Sie die Baseline-Aufzeichnung für 5 Minuten durch und perfundieren Sie dann mit aCSF, der 50 mM KCL enthält (Tabelle 1).
   HINWEIS: Das Ziel dieser Bildgebung ist es, evozierte Kalziumtransienten zu messen. Sollte ein Neuron während der Vorstimulationsphase eine basale Feueraktivität und Kalziumflüsse aufweisen, wird es nicht in der Datenanalyse verwendet. Stattdessen werden nur Zellen mit stabiler Hintergrundfluoreszenz verwendet. Die Nachstimulationsphasen können auch auf 60 min verlängert werden, wenn es sich um Calciumtransienten handelt, mit oder ohne zusätzliche kontinuierliche hohe KCl-Perfusion
.
6. Speichern Sie das Experiment und analysieren Sie die Daten mit konfokaler Software. Das Experiment kann an diesem Punkt gestoppt werden, und die Analyse kann später durchgeführt werden.
   HINWEIS: Wenn die Zellen keine Transfektion für die Expression von Proteinen von Interesse benötigen, kann dieses Protokoll zu jedem Zeitpunkt in vitro durchgeführt werden, wenn versucht wird, Kalziumtransienten zu untersuchen. Nach einem Test von Kontrollzellen, um die Messung von Kalziumtransienten sicherzustellen, sollte der Experimentator für die genetischen oder pharmakologischen Bedingungen jeder getesteten Schale verblindet werden, um Verzerrungen zu minimieren.

2. Bildanalyse

1. Öffnen Sie Zeitrafferbilder mit konfokaler Software.
2. Ausrichten von Bildern in Zeitrafferserien mit dem Befehl series: Bild | Verarbeitung | Aktuelles Dokument ausrichten. Wählen Sie An erstem Frame ausrichten aus.
3. Wählen Sie mit dem ROI-Auswahlwerkzeug (ROIs) entlang von Neuriten aus, einem bohnenförmigen Symbol auf der rechten Seite des Bildrahmens. Markieren Sie außerdem einen ROI, der die Hintergrundfluoreszenzintensität darstellt.
   HINWEIS: ROIs werden ausgewählt, indem Bereiche mit deutlich getrennten Punktzahlen entlang neuronaler Spuren ausgewählt werden, die durch das Hellfeld-Standbild angezeigt werden. Mindestens fünf ROIs pro Neuron werden für die Analyse ausgewählt. Der ROI im Hintergrund wird in einem Bereich des Sichtfelds ausgewählt, der keine Neuriten enthält.
4. Messen Sie die Rohfluoreszenz über die Zeit für ausgewählte ROIs mit der folgenden Befehlsreihe: Messen | Zeitmessung.
   1. Startet die Messfunktion im oberen Teil des Zeitmessfensters. Es werden sowohl eine grafische Darstellung der Rohfluoreszenz über die Zeit als auch quantitative Daten generiert.
      HINWEIS: Jeder Datenpunkt stellt die Rohfluoreszenz für diesen ROI für den Frame dar, der mit diesem spezifischen gemessenen Zeitpunkt verbunden ist.
5. Exportieren Sie die rohen Fluoreszenzintensitäten in die Tabellenkalkulationssoftware.

Tabelle 1: Zusammensetzung der künstlichen Puffer für die Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF).

Niedriger KCL aCSF-Puffer (pH 7,40 bis 7,45)
Reagenzkonzentration
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
Glukose	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
Hoher KCL aCSF-Puffer (pH 7,40 bis 7,45)
Reagenzkonzentration
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50 mM
Glukose	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

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