Holographische Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der neuronalen Aktivität und Konnektivität in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Kato, D. et. al., Bewertung und Manipulation der neuronalen Aktivität mit Hilfe der holographischen Zwei-Photonen-Mikroskopie. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Zwei-Photonen-Bildgebungstechnik in Kombination mit der Optogenetik mittels holographischer Mikroskopie. Unter Verwendung eines räumlichen Lichtmodulators ermöglicht diese Technik eine präzise neuronale Stimulation, die die rotlichtempfindliche Protein- und Kalziumbildgebung mit minimalem Lichtschaden exprimiert. Dieser Ansatz bietet Einblicke in die funktionale Konnektivität und Organisation neuronaler Netze.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Implantation der Kopfplatte (Abbildung 1A)

1. Verabreichen Sie das Anästhetikum (eine Mischung aus 74 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin) intraperitoneal, um die Maus zu betäuben. Überprüfen Sie regelmäßig den Narkosestatus der Maus, indem Sie die Pedalreflexe beurteilen.
2. Platzieren Sie die Maus nach der Anästhesie in einem stereotaktischen Instrument. Tragen Sie eine Augensalbe auf (siehe Tabelle der Materialien), um ein Austrocknen der Hornhaut beim Implantieren der Kopfplatte zu verhindern.
3. Rasieren Sie den Operationsbereich und desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Runden Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peelings, gefolgt von Tüchern mit 70 % Alkohol. Legen Sie den Schädel vorsichtig frei und reinigen Sie ihn mit Wattestäbchen.
   HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sollten sterilisiert werden, und alle Eingriffe sollten entsprechend durchgeführt werden. Verbleibende Ablagerungen (z. B. Haare oder getrocknetes Blut) verursachen Entzündungsreaktionen. Daher sollten alle Ablagerungen unter einem Stereoskop mit Wattestäbchen entfernt werden, die mit sterilem Wasser oder 70%igem Alkohol angefeuchtet sind.
4. Verwenden Sie die stereotaktischen Koordinaten - anterior und posterior = 0,5 mm, medial und lateral = 1,5 mm vom Bregma -, um das Zentrum der Kraniotomie zu finden und mit einem Markierungsstift zu beschriften.
5. Platzieren Sie eine individuell angefertigte Kopfplatte in der Mitte des Schädels. Tragen Sie als Nächstes Zahnzement auf (siehe Tabelle der Materialien), um ihn fest am Schädel zu befestigen. Üben Sie leichten Druck aus, bis die Kopfplatte festen Kontakt mit der Vorder- und Rückseite des Schädels hat.
   HINWEIS: Dieser Schritt dauert ca. 20 Minuten und ist entscheidend für die Reduzierung von Bewegungsartefakten im Gehirn während der Zwei-Photonen-Bildgebung. Die Abmessungen der Kopfplatte betragen 20 mm × 40 mm × 1 mm mit einer Öffnung in Form der Grundplatte, wobei eine Kante 15 mm lang, zwei benachbarte Seiten 3 mm lang und die restlichen beiden Seiten 10 mm lang sind.
6. Mischen Sie einen Dentalkleber auf Acrylbasis wie folgt zusammen: einen halben Löffel Pulver, drei Tropfen Flüssigkeit und einen Tropfen Katalysator (siehe Materialtabelle). Um ein Austrocknen zu verhindern, tragen Sie diesen gemischten Zahnadhäsivharzzement mit der Kopfplatte auf die intakte Schädeloberfläche der Maus auf.
7. Legen Sie die Maus in einen warmen Käfig, bis sie sich von der Narkose erholt hat. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.

2. Operation und Adeno-assoziierte Virusinjektion (AAV) (Abbildung 1B)

1. Führen Sie 1 Tag nach der Implantation der Kopfplatte eine Kraniotomie oder Virusinjektion durch, ohne den Zahnadhäsivharzzement aus dem Schädel zu entfernen.
   HINWEIS: Verabreichen Sie der Maus während dieses Verfahrens intraperitoneal eine Anästhesie (eine Mischung aus 74 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin).
2. Um Hirnödeme zu vermeiden, verabreichen Sie 1 h vor der Operation intraperitoneal Dexamethason-Natriumphosphat (1,32 mg/kg).
3. Betäuben Sie die Maus mit der Kopfplatte mit 1% Isofluran-Anästhesie unter Verwendung eines Verdampfers (Anästhesie-Verabreichungssystem), während Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen aufrechterhalten. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
4. Führen Sie unter einem Stereoskop eine kreisförmige Kraniotomie mit einem Durchmesser von etwa 2 mm mit einem Zahnbohrer durch. Um Hirnschäden zu reduzieren, bedienen Sie den Zahnbohrer vorsichtig mit konstanter leichter Bewegung und leichtem Druck nach unten.
5. Entfernen Sie Knochenfragmente mehrmals mit einem Absaugsystem. Verwenden Sie nach der Entfernung der Knochenfragmente eine künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF), um alle auf der Gehirnoberfläche verbleibenden Ablagerungen zu entfernen und zu waschen. Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang mehrmals, um Entzündungsreaktionen zu unterdrücken.
   HINWEIS: Die ACSF-Lösung (140 mM Natriumchlorid, NaCl, 2,5 mM Kaliumchlorid, KCl, 5 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure, HEPES, 2,0 mM Calciumchlorid, CaCl₂ und 1,0 mM Magnesiumchlorid, MgCl₂) wurde nach dem Auflösen und Filtrieren des Reagenzes 1 Monat lang bei 4 °C gelagert (Porengröße = 0,22 μm).
6. Stellen Sie unter Verwendung eines Druckinjektionssystems (siehe Tabelle der Materialien) den entsprechenden Druck (etwa 10 Pfund pro Quadratzoll (PSI) in Impulsen mit einer Dauer von 4 ms) ein, um 500 nL AAV-Lösung durch eine Glaskapillare mit einem Spitzendurchmesser von 10-20 μm (hergestellt mit einem Mikropipettenabzieher) für 10 Minuten zu injizieren.
7. Bestimmen Sie, ob die AAV-Lösung dem Gehirn verabreicht wird, indem Sie Prüfung, ob der Gehalt der AAV-Lösung in der Glaskapillare allmählich abnimmt.
8. Lassen Sie die Glaskapillare weitere 10 Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu verhindern. Wiederholen Sie dies dreimal, um insgesamt 1,5 μl AAV-Lösung in das Gehirn zu verabreichen.
9. Um die neuronale Aktivität in Pyramidenzellen der Schicht 2/3 (L2/3) zu bewerten und zu manipulieren, injizieren Sie eine AAV-Lösung (für Ca²⁺ Bildgebung: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE bei 1,28 × 10¹⁴ Vektorgenomen/ml, 1:1 verdünnt in Kochsalzlösung; für Ca²⁺ Bildgebung mit Optogenetik: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE bei 1,73 × 10¹⁴ Vektorgenomen/ml, 1:1 in Kochsalzlösung verdünnt) in den Hinterpfotenbereich des primären somatosensorischen Kortex von Wildtyp-Mäusen (S1, zentriert 0,5 mm posterior und 1,5 mm lateral vom Bregma, 150 μm Tiefe von der Oberfläche).
   HINWEIS: Die AAV-Lösung sollte 2-3 Wochen bzw. 1-2 Wochen vor der Bildgebung für die jGCaMP8f- bzw. GCaMP6m-P2A-ChRmine-Expression injiziert werden.
10. Nach einer Applikation von 2% (w/v) niedrigschmelzender Agarose auf die Hirnoberfläche von S1 mit einer Mikropipette wird ein Glasfenster mit zwei Deckgläsern über die Kraniotomie gelegt. Befestigen Sie die beiden Deckgläser (klein mit 2,0 mm Durchmesser und groß mit 4,5 mm Durchmesser; siehe Materialtabelle) mit ultraviolett (UV) härtendem Klebstoff.
11. Drücken Sie das Deckglas gegen die Agarose, solange sie noch flüssig ist; Dadurch wird die Bildung von Luftblasen in der Agarose verhindert. Versiegeln Sie die Ränder des Schädelfensters mit Zahn- und Klebeharzzement (Abbildung 1C).
12. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Instrument und setzen Sie es wieder in seinen Käfig ein. Setzen Sie die Maus in einen warmen Käfig und kehren Sie nicht mit anderen Tieren in den Käfig zurück, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Halten Sie während der Überlebensoperation sorgfältig sterile Bedingungen aufrecht.
13. Überprüfen Sie in den ersten 72 Stunden nach der Operation den Gesundheitszustand der Maus, indem Sie das allgemeine Verhalten beobachten. Wenn es Anomalien im allgemeinen Verhalten gibt, injizieren Sie subkutan entzündungshemmende und schmerzstillende Mittel.

3. Vorbereitung für das holographische Stimulations- oder Beleuchtungssystem (Abbildung 2)

1. Kalibrieren Sie das holographische Stimulationssystem, indem Sie die Oberfläche eines roten Fluoreszenzobjektträgers (gegossenes Acrylsubstrat) auf die Probenebene legen. Versetzen Sie das Mikroskop in den Live-Imaging-Modus mit schwachem Anregungslicht und führen Sie die calibration_GUI.m-Datei aus. Überprüfen Sie den Parameterbereich und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern .
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Z Scan im Fensterausschnitt von Schritt 1. Es werden automatisch drei zufällige Punkte in allen 21 Axialebenen generiert, die 2 μm von jeder Ebene entfernt sind.
3. Verschieben Sie den Schieberegler und überprüfen Sie das Live-Bild. Suchen Sie eine perfekte Ebene, in der die Punkte am kleinsten und hellsten erscheinen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern . Dadurch wird automatisch eine versetzte sphärische Wellenfront für das digitale Hologramm erzeugt.
   HINWEIS: Wenn Sie die hellsten Fluoreszenzflecken nicht finden, ändern Sie die minimalen und maximalen Werte des Scanbereichs und versuchen Sie es erneut.
4. Klicken Sie im Fensterausschnitt Schritt 2 auf die Schaltfläche Gehe zu , und klicken Sie dann auf sechs Stellen im linken Quadrat. Überprüfen Sie das Live-Bild. Wenn es sechs unterscheidbare Fluoreszenzflecken gibt, geben Sie ihre x- und y-Achse in die Bearbeitungsfelder ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Dadurch werden automatisch affine Transformationskoeffizienten generiert, um die Kalibrierung zwischen dem holographischen Stimulations- und dem Bildgebungssystem zu koordinieren.
   HINWEIS: Die Nummer des Achsenpaars und die angeklickte Punktnummer müssen der Reihe nach übereinstimmen. Wenn Sie sich nicht sicher sind oder wenn Ihr Bild keine Flecken enthält, versuchen Sie es bitte erneut und generieren Sie ein einzigartiges Fleckenmuster oder wählen Sie einen kleineren Bereich um die Mitte des Sichtfelds (FOV).
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan im Fensterausschnitt von Schritt 3. Es werden 441 digitale Hologramme generiert, um in 21 × 21 Schritten ein Einzelpunkt-Scannen über das Sichtfeld durchzuführen.
   1. Überprüfen Sie zunächst die Bilder, während Sie die Muster im Listenfeld ändern. Passen Sie dann die Laserleistung an, um Spotbilder innerhalb des Dynamikbereichs des Bildgebungsgeräts zu erhalten (z. B. um übersättigte Bilder zu vermeiden).
   2. Passen Sie anschließend die Intervallzeit im Bearbeitungsfeld an. Die Intervallzeit sollte mehr als das Doppelte der Aufzeichnungsintervallzeit betragen. Versetzen Sie abschließend das Bildgebungsgerät in den Aufnahmemodus und klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe . Wenn die Wiedergabe abgeschlossen ist, wird im Befehlsfenster die Zeichenkette "display OK" angezeigt. Stoppen Sie die Aufnahme und stapeln Sie aufgenommene sequenzielle Bilder mit der Methode der maximalen Intensität.
6. Klicken Sie im Bereich Schritt 4 auf WM generieren und wählen Sie ein gestapeltes Bild von oben aus. Schließen Sie dann das Fenster calibration_GUI. Es wird automatisch eine Gewichtskarte erstellt, um die unausgewogene Intensität an jedem Punkt auszugleichen.
   HINWEIS: Für eine detailliertere Beschreibung kann der MATLAB-Code hier heruntergeladen werden (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Ca²⁺-Bildgebung mit einem Bildsensor mit holografischer Beleuchtung (Abbildung 3)

1. Platzieren Sie die AAV-injizierte Maus mit einer Kopfplatte unter dem Mikroskop (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Während dieses Vorgangs wird die Maus im wachen Zustand fixiert, kann sich aber unangenehmen Reizen entziehen.
2. Führen Sie eine Zwei-Photonen-Bildgebung (Punktscan-Modus) mit einem holographischen Mikroskop und einem modengekoppelten Ti-Saphir-Laser durch, der auf 920 nm mit einem 25-fachen Objektiv abgestimmt ist (siehe Tabelle der Materialien).
3. Schalten Sie die kommerzielle Bildgebungssoftware ein (siehe Table of Materials). Passen Sie im Live-Imaging-Modus die Spannung des Bilddetektors (siehe Table of Materials) und die Leistung des Imaging-Lasers an, um die Helligkeit der Neuronen zu optimieren, die jGCaMP8f exprimieren. Nehmen Sie Bilder der Neuronen auf, die dieses Protein exprimieren.
   HINWEIS: Die Intensität des abbildenden Lasers (920 nm) beträgt 20-30 mW. Das FOV betrug 512 μm × 512 μm in einer Tiefe von 100-150 μm von der kortikalen Oberfläche.
4. Um bestimmte Neuronen, die jGCaMP8f exprimieren, mit holografischer Beleuchtung zu beleuchten, führen Sie die Skriptdatei SLMcontrol.m aus. Klicken Sie auf das Referenzbild und wählen Sie das oben aufgenommene Bild aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Spot , um bestimmte Pixel auf den Neuronen im Bild durch kontinuierliches Klicken auszuwählen (Abbildung 3A). Wenn die Auswahl abgeschlossen ist, drücken Sie die Eingabetaste Enter auf der Tastatur, um sie abzuschließen.
   HINWEIS: Das digitale Hologramm wird automatisch berechnet und auf dem räumlichen Lichtmodulator (SLM) angezeigt. Dieses Muster kann auch durch Klicken auf ein Listenfeld erneut aufgerufen werden. Die räumliche Auflösung eines einzelnen Spots, der durch das SLM erzeugt wurde, betrug ca. 1,2 μm entlang der Querrichtung und ~8,3 μm entlang der optischen Achse. Wir haben eine Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur (1,1) verwendet, um eine lokalere holografische Stimulation zu erzielen.
5. Um neuronale Aktivität mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Bildsensor zu erkennen (siehe Materialtabelle), stellen Sie die Belichtungszeit, den Bildbereich und das Binning ein (Abbildung 3B), bevor Sie die Bildaufnahme durchführen (Abbildung 3C).
   HINWEIS: Die Intensität des holographischen Beleuchtungslasers (920 nm), der ein Neuron kontinuierlich stimuliert, beträgt 2 mW, was ausreicht, um neuronale Aktivität zu erkennen. Um beispielsweise eine Bildrate von 100 Hz für die Bildgebung zu erreichen, beträgt die Belichtungszeit 9 ms, der Bildgebungsbereich 400 μm × 400 μm und das Binning 4.
6. Bringen Sie die Maus nach dem Experiment in ihren Heimatkäfig zurück.

5. Zwei-Photonen-Bildgebung (Punktscan-Modus) mit Optogenetik unter Verwendung eines holographischen Mikroskops (Abbildung 4)

1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2.
2. Schalten Sie die kommerzielle Bildgebungssoftware ein (siehe Table of Materials). Passen Sie im Live-Imaging-Modus die Spannung des Bilddetektors (siehe Table of Materials) und die Leistung des Imaging-Lasers an, um die Helligkeit der Neuronen zu optimieren, die GCaMP6m-P2A-ChRmine exprimieren. Nehmen Sie Bilder der Neuronen auf, die diese Proteine exprimieren (Abbildung 1E).
3. Wiederholen Sie Schritt 4.4.
4. Um die funktionelle Konnektivität innerhalb von L2/3-Neuronen zu untersuchen, verwenden Sie ein SLM, um holographische Muster der optogenetischen Stimulation (ChRmine; 1.040 nm) zu generieren und es mit Zwei-Photonen-Ca²⁺-Bildgebung (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 Pixel, 2 Hz oder 30 Hz, 2-facher digitaler Zoom, Punktscan-Modus; Abbildung 3D-H).
   1. Für dieses Protokoll stellen Sie die Intensität des abbildenden Lasers auf 920 nm bei 10-20 mW und das Sichtfeld auf 256 μm × 256 μm ein, gemessen in einer Tiefe von 100-150 μm von der kortikalen Oberfläche. Stellen Sie die Verweilzeit des Pixels auf 1,5 μs für 2 Hz oder 100 ns für 30 Hz ein.
   2. Um zu sehen, ob ein einzelner holografischer Stimulus eine Kalziumreaktion in den Neuronen ausgelöst hat, verwenden Sie sowohl 2 Hz als auch 30 Hz als Bildrate. Stellen Sie die Intensität des holographischen Stimulationslasers (1.040 nm), der ein einzelnes Neuron stimuliert, auf 10 mW ein, was ausreicht, um neuronale Aktivität zu induzieren (Abbildung 3D).
      HINWEIS: Die räumliche Auflösung eines einzelnen Punkts, der vom SLM erzeugt wird, beträgt ungefähr 1,2 μm entlang der Querrichtung und ~8,3 μm entlang der optischen Achse. Der Bereich des zugänglichen Volumens in lateraler Richtung liegt bei etwa 500 μm × 500 μm und 100 μm in axialer Richtung. Des Weiteren haben wir mit Ca²⁺ Bildgebung bei 2 Hz oder 30 Hz Bildrate bestätigt, dass nicht nur ein Neuron, sondern mehrere Neuronen gleichzeitig holographisch stimuliert werden können (Abbildung 3E).
5. Führen Sie die Bildaufnahme mit dem folgenden Protokoll durch: Gleichzeitiges Bild der Ca²⁺-Reaktion bei 920 nm mit 10 holographischen Stimuli bei 1.040 nm mit 8-s-Intervallen (0,125 Hz) für eine Dauer von 50 ms nach einer Basislinienperiode von 10 s.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs. (A) Fixierung der Kopfplatte am Schädel. (B) Stereotaktische Injektion von AAV in den Hinterpfotenbereich des primären somatosensorischen Kortex (S1HL)....

Materialien